人表皮生長(zhǎng)因子受體2基因擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒（熒光原位雜交法）注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則（2017年第209號(hào)）

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人表皮生長(zhǎng)因子受體2基因擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒（熒光原位雜交法）注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊(cè)申請(qǐng)人對(duì)人表皮生長(zhǎng)因子受體2基因擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒（熒光原位雜交法）注冊(cè)申報(bào)資料的準(zhǔn)備及撰寫，同時(shí)也為技術(shù)審評(píng)部門審評(píng)注冊(cè)申報(bào)資料提供參考。

本指導(dǎo)原則是對(duì)人表皮生長(zhǎng)因子受體2基因擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒（熒光原位雜交法）的一般要求，申請(qǐng)人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和細(xì)化。

本指導(dǎo)原則是供申請(qǐng)人和審查人員使用的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊(cè)審批所涉及的行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但需要提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料，相關(guān)人員應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)體系及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善和科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時(shí)進(jìn)行調(diào)整。

一、范圍

人表皮生長(zhǎng)因子受體2（Human Epidermal growth factor Receptor 2，HER2）基因定位于染色體17q12，是表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）的成員之一，HER2基因編碼分子量為185kDa的酪氨酸激酶活性跨膜糖蛋白。HER2蛋白主要通過與家族中其他成員形成異二聚體而與各自的配體結(jié)合；當(dāng)異二聚體與配體結(jié)合后，激活酪氨酸激酶的活性。參與細(xì)胞的增殖、凋亡調(diào)控、血管和淋巴管新生等生物學(xué)功能。HER2蛋白的過表達(dá)主要是由于HER2基因的擴(kuò)增，可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的異常活化，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。HER2基因的擴(kuò)增和蛋白的過表達(dá)均可稱為HER2陽性，該情況出現(xiàn)于部分原發(fā)性浸潤(rùn)性乳腺癌、胃及胃和食管交界處癌（以下統(tǒng)稱胃癌）等患者中。

對(duì)于浸潤(rùn)性乳腺癌適應(yīng)癥，HER2陽性是指免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry，IHC）檢測(cè)結(jié)果為（3+），或原位雜交方法（In situ Hybridization，ISH）檢測(cè)結(jié)果為基因擴(kuò)增。而IHC檢測(cè)結(jié)果為（2+）的病例為不確定，需進(jìn)一步應(yīng)用原位雜交方法進(jìn)行HER2擴(kuò)增狀態(tài)的檢測(cè)。對(duì)于胃癌適應(yīng)癥，HER2陽性是指IHC檢測(cè)結(jié)果為HER2（2+）的同時(shí)ISH檢測(cè)結(jié)果為基因擴(kuò)增，或IHC檢測(cè)結(jié)果為HER2（3+）。

對(duì)HER2陽性的乳腺癌和胃癌患者進(jìn)行聯(lián)合抗HER2靶向治療（如抗HER2單克隆抗體、小分子酪氨酸激酶抑制劑等）使得部分患者的生存狀況得到改善，但是在HER2陰性的患者中沒有效果。準(zhǔn)確地檢測(cè)HER2蛋白表達(dá)和基因擴(kuò)增狀態(tài)是抗HER2單克隆抗體分子靶向治療患者篩選和療效預(yù)測(cè)的前提，對(duì)乳腺癌和胃癌的臨床治療和/或預(yù)后判斷至關(guān)重要。對(duì)于浸潤(rùn)性乳腺癌適應(yīng)癥，HER2是患者重要的預(yù)后指標(biāo)，也是抗HER2藥物治療的主要預(yù)測(cè)指標(biāo)。對(duì)于胃癌適應(yīng)癥，HER2是晚期胃癌的療效預(yù)測(cè)標(biāo)志物。

本指導(dǎo)原則適用于采用熒光原位雜交方法檢測(cè)手術(shù)切除樣本和活檢樣本的組織切片中的HER2基因擴(kuò)增情況，包括HER2基因平均拷貝數(shù)（單信號(hào)）、HER2基因平均拷貝數(shù)和該基因所在的第17號(hào)染色體著絲粒（CEP17）序列平均拷貝數(shù)的比值（雙信號(hào)）。對(duì)于其他應(yīng)用亮視野原位雜交法檢測(cè)HER2基因擴(kuò)增水平的方法，如顯色原位雜交法（Chromogenic In Situ Hybridization，CISH）和銀增強(qiáng)原位雜交法（Silver—enhanced In Situ Hybridization，SISH），可能部分要求不完全適用或本文所述技術(shù)指標(biāo)不夠全面，申請(qǐng)人可以根據(jù)產(chǎn)品特性對(duì)不適用部分進(jìn)行修訂或補(bǔ)充其他的評(píng)價(jià)和驗(yàn)證資料，但需闡述不適用的理由，并驗(yàn)證替代方法的科學(xué)合理性。

本指導(dǎo)原則適用于進(jìn)行首次注冊(cè)申報(bào)和相關(guān)許可事項(xiàng)變更的產(chǎn)品。其他未盡事宜（包括產(chǎn)品風(fēng)險(xiǎn)分析資料等），應(yīng)當(dāng)符合《體外診斷試劑注冊(cè)管理辦法》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局令第5號(hào)，以下簡(jiǎn)稱《辦法》）等相關(guān)法規(guī)要求。

二、注冊(cè)申報(bào)資料要求

（一）綜述資料

綜述資料的撰寫應(yīng)符合《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局公告2014年第44號(hào)）（以下簡(jiǎn)稱2014年第44號(hào)公告）的相關(guān)要求。內(nèi)容主要包括產(chǎn)品預(yù)期用途、產(chǎn)品描述、有關(guān)生物安全性的說明、有關(guān)產(chǎn)品主要研究結(jié)果的總結(jié)和評(píng)價(jià)以及同類產(chǎn)品在國(guó)內(nèi)外批準(zhǔn)上市的情況介紹等內(nèi)容。重點(diǎn)內(nèi)容要求如下：

1.預(yù)期用途：HER2基因及其家族簡(jiǎn)介，在相關(guān)適應(yīng)癥中的表達(dá)情況，與組織病理學(xué)特征的關(guān)系，其擴(kuò)增情況與乳腺癌和胃癌治療方案制定以及預(yù)后判斷的關(guān)系等。

2.產(chǎn)品描述：熒光原位雜交法（Fluorescence In Situ Hybridization，F(xiàn)ISH）的技術(shù)原理，目標(biāo)基因的座位區(qū)域，探針的設(shè)計(jì)原則以及標(biāo)記的熒光染料，細(xì)胞核復(fù)染方式，以及結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)和統(tǒng)計(jì)方式等。

3.同類產(chǎn)品上市情況：與相同或相似方法學(xué)（如IHC、其他原位雜交方法等）的產(chǎn)品在性能、上市情況和結(jié)果判讀等方面的比較。

（二）主要原材料研究資料

申請(qǐng)人應(yīng)驗(yàn)證主要原材料的性能指標(biāo)符合產(chǎn)品研發(fā)、生產(chǎn)和檢驗(yàn)要求，以確定設(shè)計(jì)要求或者外購廠家，并制定主要原材料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1.探針：根據(jù)不同用途，分為基因特異性探針（HER2）和著絲粒探針（CEP17）兩種類型。探針可選擇細(xì)菌人工染色體（BAC）克隆或者聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）等方法進(jìn)行制備。下述內(nèi)容是對(duì)于探針制備通用要求的舉例，如有其他替代方法，應(yīng)詳細(xì)闡述其科學(xué)合理性。

1.1基因特異性探針

1.1.1探針序列的確定：包括探針?biāo)诨虻奈恢脜^(qū)域，人類基因組文庫的篩選、比對(duì)和特征確認(rèn)過程。

1.1.2人類基因組文庫克隆的鑒定：一般檢測(cè)與基因區(qū)域相關(guān)的序列標(biāo)記位點(diǎn)（STS）的存在情況，包括引物的設(shè)計(jì)，PCR過程和產(chǎn)物的電泳圖譜。

1.1.3探針的標(biāo)記：一般為酶促反應(yīng)或者化學(xué)合成方法，應(yīng)詳述標(biāo)記方式的選擇、反應(yīng)體系和過程、產(chǎn)物的純化方式等。

1.2著絲粒探針：包括微衛(wèi)星重復(fù)單元的序列，PCR引物的設(shè)計(jì)和選擇，熒光染料標(biāo)記的反應(yīng)體系、過程和產(chǎn)物的純化方式等。

1.3探針的質(zhì)量控制：性能指標(biāo)一般包括濃度、純度、Tm值（如適用）、雜交效率、特異性等，可使用測(cè)定260nm處紫外吸收峰值、測(cè)定260nm與280nm處紫外吸收峰值的比值、瓊脂糖凝膠電泳、染色體分散良好的中期相分裂細(xì)胞雜交驗(yàn)證等方式。

2.熒光染料：技術(shù)指標(biāo)包括最大發(fā)射/吸收峰，與目的核酸片段的結(jié)合能力，持續(xù)被激發(fā)光源照射時(shí)的抗淬滅能力等。

3.雜交緩沖液：應(yīng)描述組成配方，說明各成分的作用。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)包括pH值、鹽離子濃度、甲酰胺濃度、硫酸葡聚糖濃度等。

4.人Cot-1 DNA（如適用）：是由大量人類基因組重復(fù)序列組成的高濃度DNA，能封閉樣品中的DNA重復(fù)序列，降低檢測(cè)背景。要求能有效封閉背景信號(hào)，避免由于非特異性雜交而影響檢測(cè)結(jié)果的判讀。應(yīng)評(píng)價(jià)人Cot-1 DNA對(duì)樣本檢測(cè)背景信號(hào)的封閉效果，方法可選擇通過觀察背景強(qiáng)度以及非特異雜交的強(qiáng)度而確定人 Cot-1 DNA的用量。如有其他清除背景信號(hào)的方法，應(yīng)充分說明其科學(xué)合理性。

5.二脒基苯基吲哚（DAPI）復(fù)染劑：評(píng)價(jià)指標(biāo)包括對(duì)細(xì)胞核的染色能力以及抗淬滅能力等。

6.企業(yè)參考品：應(yīng)包含陰性參考品、陽性參考品和特異性參考品，并詳細(xì)說明參考品的來源、組成、制備和保存情況。陽性參考品可選擇經(jīng)已上市產(chǎn)品確認(rèn)HER2基因擴(kuò)增的乳腺浸潤(rùn)癌/胃癌組織，或者人乳腺癌/胃癌細(xì)胞株。陰性參考品可選擇經(jīng)已上市產(chǎn)品確認(rèn)HER2基因無擴(kuò)增的腫瘤組織，或者腫瘤細(xì)胞株。特異性參考品可選擇健康人外周血培養(yǎng)細(xì)胞，應(yīng)含有較多染色體分散良好的中期分裂相淋巴細(xì)胞。

7.質(zhì)控片（如有）：可作為試劑盒的組分或者單獨(dú)配置，包含陰性質(zhì)控片、臨界值質(zhì)控片和/或陽性質(zhì)控片?？蛇x擇臨床組織樣本或者HER2擴(kuò)增狀態(tài)確定的細(xì)胞株。

（三）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料

申請(qǐng)人應(yīng)描述主要生產(chǎn)工藝及確定依據(jù)，詳述工序流程以及各個(gè)步驟的質(zhì)量關(guān)鍵控制點(diǎn)。

申請(qǐng)人應(yīng)建立適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)體系，以平衡最佳檢測(cè)信號(hào)和背景強(qiáng)度的關(guān)系。反應(yīng)過程包括樣本預(yù)處理和雜交檢測(cè)兩個(gè)步驟，其中樣本預(yù)處理過程一般包括樣本脫蠟、樣本預(yù)處理、蛋白酶處理三個(gè)環(huán)節(jié)，雜交檢測(cè)過程一般包括變性、雜交、雜交后洗滌、DAPI復(fù)染四個(gè)環(huán)節(jié)。另外，應(yīng)合理控制樣本的質(zhì)量并明確要求。

1.樣本的采集、固定、制片、保存和運(yùn)輸：應(yīng)對(duì)采樣部位及方法、樣本中腫瘤組織的含量、離體到固定的溫度及時(shí)間、固定溫度及時(shí)間、保存和運(yùn)輸?shù)臈l件和時(shí)間進(jìn)行研究或者驗(yàn)證，結(jié)合組織形態(tài)及病理學(xué)特征，保證樣本的準(zhǔn)確性以及其中DNA的完整性。另外，切片質(zhì)量對(duì)檢測(cè)結(jié)果的判讀十分重要，應(yīng)對(duì)切片厚度進(jìn)行研究或者驗(yàn)證，要求計(jì)數(shù)區(qū)域的細(xì)胞胞核邊界完整、DAPI染色均一、細(xì)胞核無重疊、熒光信號(hào)清晰。不同類型的樣本應(yīng)分別驗(yàn)證。具體可參考國(guó)際或國(guó)內(nèi)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程；如與標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程有差異，應(yīng)進(jìn)行充分研究。

2.樣本預(yù)處理：應(yīng)對(duì)脫蠟條件、預(yù)處理溫度及時(shí)間、特定鹽溶液的離子強(qiáng)度、蛋白酶的消化條件進(jìn)行充分研究，以避免處理過程中組織和DNA的損失造成檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陰性。如其中預(yù)處理過程可選擇多個(gè)溫度/時(shí)間的組合，蛋白酶消化過程可選擇多個(gè)持續(xù)時(shí)間進(jìn)行研究。溫度/時(shí)間的組合是指首先在同一時(shí)期的幾個(gè)不同溫度下進(jìn)行，然后在優(yōu)化溫度條件下的幾個(gè)不同持續(xù)時(shí)間進(jìn)行。

3.樣本變性條件：應(yīng)對(duì)樣本變性處理的溫度、持續(xù)時(shí)間的組合進(jìn)行充分研究，以保證樣本中DNA雙鏈的充分解鏈，有利于后續(xù)探針和樣本的結(jié)合，提高雜交效率以及保證雜交的特異性。如選擇多個(gè)溫度/時(shí)間的組合進(jìn)行研究。

4.樣本雜交條件：應(yīng)對(duì)樣本雜交步驟的溫度、持續(xù)時(shí)間的組合進(jìn)行充分研究，以達(dá)到探針和樣本的最佳結(jié)合效率。如選擇多個(gè)溫度/時(shí)間的組合進(jìn)行研究。

5.雜交后洗滌條件：應(yīng)對(duì)緩沖液的鹽濃度和去垢劑成分，以及清洗溫度、時(shí)間、次數(shù)的組合進(jìn)行充分研究，以達(dá)到最佳的雜交嚴(yán)格度。要求盡可能去除樣本中的核蛋白等干擾物質(zhì)，避免非特異性雜交，降低背景干擾，并且增加目標(biāo)信號(hào)的強(qiáng)度。如選擇多個(gè)緩沖液濃度以及多個(gè)清洗條件的組合進(jìn)行研究。

（四）分析性能評(píng)估資料

申請(qǐng)人應(yīng)使用多批產(chǎn)品進(jìn)行研究，建立穩(wěn)定可靠的性能指標(biāo)。需提交在產(chǎn)品研制和成品驗(yàn)證階段對(duì)試劑盒進(jìn)行的所有性能評(píng)價(jià)的研究資料，包括方案設(shè)計(jì)、研究方法、材料和設(shè)備、驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)、試驗(yàn)數(shù)據(jù)（包括代表性彩色圖片）和結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析等詳細(xì)資料。建議著重對(duì)以下性能指標(biāo)進(jìn)行研究：

1.靈敏度

主要反映產(chǎn)品檢測(cè)時(shí)探針與目標(biāo)基因位點(diǎn)的結(jié)合效率，也稱為雜交效率。由于組織固定時(shí)蛋白質(zhì)和核酸產(chǎn)生的分子間交聯(lián)等對(duì)靶核酸具有屏蔽作用，探針穿透細(xì)胞的能力不同，導(dǎo)致產(chǎn)品對(duì)于不同類型樣本的雜交效率存在性能差異；應(yīng)使用臨床應(yīng)用環(huán)境中所有可能的樣本類型中具有代表性的類型進(jìn)行評(píng)估。方法可選擇20個(gè)乳腺浸潤(rùn)癌/胃癌病例的組織樣本，以及20個(gè)癌旁正常組織或者良性疾病組織樣本；對(duì)同樣數(shù)量的細(xì)胞隨機(jī)進(jìn)行分析計(jì)數(shù)。每例組織樣本應(yīng)至少檢測(cè)20個(gè)細(xì)胞，分析統(tǒng)計(jì)HER2基因熒光信號(hào)數(shù)量，或者同時(shí)顯示HER2基因位點(diǎn)標(biāo)記和第17號(hào)染色體著絲粒（CEP17）位點(diǎn)標(biāo)記的熒光信號(hào)的細(xì)胞占全部細(xì)胞的比例。

2.特異性

主要反映HER2和CEP17探針對(duì)目標(biāo)序列識(shí)別的特異性。建議使用中期分裂相的外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行涂片分析。選擇5份以上正常人的外周血培養(yǎng)細(xì)胞涂片樣本，每例樣本應(yīng)至少檢測(cè)20個(gè)染色體分散良好的中期分裂相細(xì)胞，對(duì)至少200個(gè)靶位點(diǎn)進(jìn)行分析計(jì)數(shù)；結(jié)合染色體G顯帶分析，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞核染色體上正確位點(diǎn)的雜交信號(hào)占全部雜交信號(hào)的比例。應(yīng)使用標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)識(shí)別信號(hào)位點(diǎn)，例如染色體形態(tài)學(xué)分析、染色體區(qū)段染色、反向DAPI條帶等技術(shù)；考察在HER2基因位點(diǎn)（17q11.2-q12）和/或第17號(hào)染色體著絲粒位點(diǎn)（17q11.2-q11.1）的特定熒光信號(hào)占全部熒光信號(hào)的比例。

3.陰、陽性符合率

主要反映產(chǎn)品對(duì)不同類型樣本中HER2基因的檢出能力和準(zhǔn)確性。應(yīng)使用臨床應(yīng)用環(huán)境中所有可能的樣本類型中具有代表性的組織類型進(jìn)行評(píng)價(jià)，并提供樣本來源、唯一可溯源編號(hào)、病理組織類型，以及明確的HER2基因擴(kuò)增狀態(tài)。對(duì)于適應(yīng)癥為乳腺癌的情況，用于評(píng)價(jià)的樣本類型應(yīng)包括乳腺浸潤(rùn)性癌非特殊類型、乳腺浸潤(rùn)性小葉癌、小管癌、粘液癌，良性疾?。ㄈ缦俨〖袄w維腺瘤）以及正常乳腺組織等。對(duì)于適應(yīng)癥為胃癌的情況，用于評(píng)價(jià)的樣本類型應(yīng)包括腸型、彌漫型、混合型（Lauren分型）胃癌，良性疾?。ㄈ缥刚衬ぢ匝装Y）以及正常胃組織等。每種組織類型設(shè)置2至3例樣本進(jìn)行評(píng)價(jià)。建議著重評(píng)價(jià)申報(bào)產(chǎn)品對(duì)IHC檢測(cè)結(jié)果為HER2（2+）樣本的HER2基因擴(kuò)增狀態(tài)的檢測(cè)能力。

4.精密度

申請(qǐng)人應(yīng)充分考慮到配套檢測(cè)系統(tǒng)以及使用環(huán)境的因素：包括熒光顯微鏡的特征、激發(fā)光源及過濾器的性能參數(shù)、物鏡放大倍數(shù)等，以及不同時(shí)間、地點(diǎn)、操作人員、檢測(cè)次數(shù)對(duì)結(jié)果判讀的影響；對(duì)可能導(dǎo)致檢測(cè)之間差異的主要變量進(jìn)行驗(yàn)證。用于精密度評(píng)價(jià)的參考品應(yīng)選擇HER2擴(kuò)增、HER2無擴(kuò)增以及臨界值的連續(xù)切片組織樣本。其中臨界值樣本和成簇?cái)U(kuò)增的樣本應(yīng)分別設(shè)置驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)（標(biāo)準(zhǔn)差以及變異系數(shù)的范圍）。建議參考下述方法進(jìn)行各個(gè)指標(biāo)的評(píng)價(jià)：

4.1批內(nèi)精密度：由同一操作人員使用同一批次產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)，每例樣本重復(fù)檢測(cè)多次，對(duì)結(jié)果判讀的一致性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

4.2批間精密度：由同一操作人員使用多個(gè)批次產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)，每例樣本重復(fù)檢測(cè)多次，對(duì)結(jié)果判讀的一致性進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。

4.3日間精密度：在多個(gè)不同日期，由同一操作人員使用同一批次產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)結(jié)果判讀的一致性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

4.4人員間精密度：由數(shù)位操作人員使用同一批次產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)，每份樣本由數(shù)位閱片人員進(jìn)行獨(dú)立結(jié)果判讀。對(duì)不同操作人員/閱片人員對(duì)同一例組織樣本檢驗(yàn)方法以及結(jié)果判讀的一致性進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。

4.5室間精密度：建議申請(qǐng)人選擇不同的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)間一致性的評(píng)價(jià)。

（五）陽性判斷值確定資料

HER2檢測(cè)結(jié)果的判讀標(biāo)準(zhǔn)不斷進(jìn)行著更新，申請(qǐng)人應(yīng)參考最新版臨床指南性文件建立陽性判斷值。應(yīng)提交申報(bào)產(chǎn)品判讀規(guī)則以及預(yù)設(shè)陽性判斷值所依據(jù)的文獻(xiàn)資料，并采用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義數(shù)量的樣本對(duì)判讀規(guī)則以及預(yù)設(shè)陽性判斷值進(jìn)行驗(yàn)證。應(yīng)包含HER2擴(kuò)增、HER2無擴(kuò)增以及一定數(shù)量的臨界值（陽性判斷值附近）組織樣本，包括HER2/CEP17熒光信號(hào)總數(shù)比值在2附近（1.8～2.2），或者每個(gè)細(xì)胞的平均HER2拷貝數(shù)在4～6附近的樣本。

首先設(shè)定檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性較好的目標(biāo)，即HER2平均拷貝數(shù)或者HER2平均拷貝數(shù)/CEP17平均拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)差/變異系數(shù)范圍驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)，確定初始統(tǒng)計(jì)細(xì)胞區(qū)域和數(shù)量，并在結(jié)果不確定時(shí)納入更多區(qū)域或數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

然后建議參照組織病理學(xué)特征或者IHC結(jié)果確定可能存在擴(kuò)增的浸潤(rùn)性乳腺癌/胃癌區(qū)域，選擇細(xì)胞核大小一致、胞核邊界完整、DAPI染色均一、細(xì)胞核無重疊、熒光信號(hào)清晰的細(xì)胞，隨機(jī)計(jì)數(shù)2個(gè)區(qū)域中的至少20個(gè)細(xì)胞，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

（六）穩(wěn)定性研究資料

根據(jù)本產(chǎn)品特性，申請(qǐng)人應(yīng)分別從實(shí)時(shí)穩(wěn)定性、運(yùn)輸穩(wěn)定性、開瓶/凍融穩(wěn)定性，以及使用過程中的雜交后信號(hào)穩(wěn)定性、探針的光照穩(wěn)定性等方面對(duì)產(chǎn)品的穩(wěn)定性進(jìn)行研究，充分考慮在實(shí)際的運(yùn)輸、保存和使用條件下對(duì)產(chǎn)品性能的影響。其中使用過程穩(wěn)定性應(yīng)評(píng)價(jià)在實(shí)際使用的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境條件下，不同的光照條件對(duì)熒光標(biāo)記探針以及雜交后樣本熒光信號(hào)強(qiáng)度的影響，注意應(yīng)覆蓋檢測(cè)的全過程。評(píng)價(jià)指標(biāo)應(yīng)至少包括靈敏度、特異性以及熒光信號(hào)強(qiáng)度。

樣本中核酸的完整性對(duì)于結(jié)果的正確判讀也十分關(guān)鍵。申請(qǐng)人應(yīng)充分考慮臨床樣本采集、處理、運(yùn)輸、儲(chǔ)存與切片制備等各個(gè)階段的條件，如溫度、濕度對(duì)樣本質(zhì)量的影響，全面評(píng)價(jià)臨床樣本、質(zhì)控品和企業(yè)參考品的穩(wěn)定性。樣本穩(wěn)定性應(yīng)分別評(píng)價(jià)石蠟包埋組織塊與組織切片的穩(wěn)定性，評(píng)價(jià)指標(biāo)應(yīng)至少包括儲(chǔ)存溫度及時(shí)間。

（七）臨床評(píng)價(jià)資料

臨床試驗(yàn)總體要求及臨床試驗(yàn)資料的內(nèi)容應(yīng)符合《辦法》、2014年第44號(hào)公告和《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》的規(guī)定，以下僅結(jié)合人表皮生長(zhǎng)因子受體2基因擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒（熒光原位雜交法）的具體特點(diǎn)對(duì)其臨床試驗(yàn)中應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注的內(nèi)容進(jìn)行闡述。

1.臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)及人員的要求

申請(qǐng)人應(yīng)當(dāng)選定不少于3家（含3家）已備案的醫(yī)療器械臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)，按照有關(guān)規(guī)定開展臨床試驗(yàn)。申請(qǐng)人應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品特點(diǎn)及其預(yù)期用途，綜合不同地區(qū)人種、流行病學(xué)背景等因素選擇臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)。臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)必須具有與申報(bào)試劑相適應(yīng)的專業(yè)技術(shù)人員及儀器設(shè)備，并能夠確保該項(xiàng)試驗(yàn)的實(shí)施。

2.試驗(yàn)方案

2.1各臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的方案設(shè)置應(yīng)基本一致，且保證在整個(gè)臨床試驗(yàn)過程中遵循預(yù)定的方案實(shí)施，不可隨意改動(dòng)。整個(gè)試驗(yàn)過程應(yīng)在臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)并由本實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)人員操作完成，需強(qiáng)調(diào)組織標(biāo)本的標(biāo)準(zhǔn)采樣、及時(shí)在10%中性緩沖福爾馬林溶液中充分固定及其他標(biāo)準(zhǔn)操作程序。申報(bào)單位的技術(shù)人員除進(jìn)行必要的技術(shù)指導(dǎo)外，不得隨意干涉試驗(yàn)進(jìn)程，尤其是數(shù)據(jù)收集過程。

2.2以圖表的形式對(duì)試驗(yàn)總體設(shè)計(jì)及工作流程進(jìn)行描述，圖表中應(yīng)包括連續(xù)切片的數(shù)量及用途分配等。各臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)選用的對(duì)比試劑應(yīng)保持一致，以便進(jìn)行合理的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.3試驗(yàn)方案中應(yīng)確定嚴(yán)格的病例納入/排除選擇標(biāo)準(zhǔn)，任何已經(jīng)入選的病例再被排除出臨床試驗(yàn)都應(yīng)記錄在案，并明確說明原因。

2.4試驗(yàn)方案中應(yīng)明確閱片者、操作者的選擇標(biāo)準(zhǔn)。閱片者應(yīng)選擇在免疫組織化學(xué)、熒光原位雜交技術(shù)應(yīng)用和乳腺癌/胃癌病理診斷中有豐富經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)學(xué)工作者。

2.5在試驗(yàn)操作過程中和判定檢測(cè)結(jié)果時(shí)應(yīng)采用盲法以保證試驗(yàn)結(jié)果的客觀性。臨床試驗(yàn)研究方案中應(yīng)詳述盲法的具體操作流程。

2.6臨床試驗(yàn)前申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)參與人員進(jìn)行相關(guān)技術(shù)培訓(xùn)，并采用統(tǒng)一判讀標(biāo)準(zhǔn)，保持各臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的判讀一致性。注意判讀方法與說明書要求一致。

2.7在整個(gè)試驗(yàn)中，試驗(yàn)用體外診斷試劑和對(duì)比試劑都應(yīng)處于有效的質(zhì)量控制下，最大限度保證試驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及可重復(fù)性。臨床試驗(yàn)研究方案中應(yīng)明確質(zhì)控方法及配合用質(zhì)控試劑的詳細(xì)信息。

3.試驗(yàn)方法

3.1“已有同品種批準(zhǔn)上市”產(chǎn)品

應(yīng)選擇已批準(zhǔn)上市，且已經(jīng)充分聯(lián)合藥物進(jìn)行臨床評(píng)價(jià)的伴隨診斷試劑作為對(duì)比試劑，證明本品與已上市產(chǎn)品等效。

3.2新產(chǎn)品

用于胃癌等其他用途的此類檢測(cè)試劑，如無已上市同類產(chǎn)品，應(yīng)選擇臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)已建立的參考方法（應(yīng)可報(bào)告腫瘤細(xì)胞HER2基因平均拷貝數(shù)和腫瘤細(xì)胞CEP17平均拷貝數(shù)）為參比方法，進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果的一致性研究。該參考方法應(yīng)已經(jīng)充分聯(lián)合藥物進(jìn)行臨床評(píng)價(jià)。

3.3對(duì)于預(yù)期用途中已明確配合具體治療藥物名稱的檢測(cè)試劑，應(yīng)采用聯(lián)合藥物評(píng)價(jià)臨床試驗(yàn)的形式，同時(shí)評(píng)價(jià)檢測(cè)結(jié)果與接受靶向治療藥物后療效的相關(guān)性和試驗(yàn)用體外診斷試劑檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

3.4臨床試驗(yàn)用樣本的選擇和樣本量

臨床試驗(yàn)應(yīng)選擇經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林固定的石蠟包埋組織樣本或組織芯片。

應(yīng)根據(jù)設(shè)定的符合率接受標(biāo)準(zhǔn)和選定的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分別計(jì)算總樣本例數(shù)及IHC檢測(cè)結(jié)果為HER2（2+）的樣本例數(shù)。但總樣本例數(shù)不低于1000例。其中IHC檢測(cè)結(jié)果為HER2（2+）的樣本不少于400例。如申報(bào)試劑聲稱可以用于檢測(cè)兩種或兩種以上腫瘤類型，則應(yīng)在一種類型滿足上述要求的基礎(chǔ)上，對(duì)每種新增的腫瘤類型進(jìn)行不少于300例樣本的臨床驗(yàn)證，IHC檢測(cè)結(jié)果為HER2（2+）的樣本不少于120例。樣本的選擇應(yīng)包含臨床預(yù)期使用人群和特異性樣本，注意包含臨床相關(guān)的各種病理組織類型。

對(duì)于適應(yīng)癥為浸潤(rùn)性乳腺癌的情況，樣本應(yīng)包含臨床常見的各種浸潤(rùn)性乳腺癌病理組織類型，如乳腺浸潤(rùn)性癌非特殊類型、乳腺浸潤(rùn)性小葉癌、小管癌、粘液癌。特異性樣本應(yīng)包含腺病及纖維腺瘤。

對(duì)于適應(yīng)癥為胃癌的情況，樣本應(yīng)包含臨床常見的各種腺癌病理組織類型，如腸型、彌漫型、混合型（Lauren分型）。特異性樣本應(yīng)包含胃粘膜慢性炎。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

4.1對(duì)臨床試驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)應(yīng)選擇合適的統(tǒng)計(jì)方法。

4.1.1對(duì)于本類試劑，常以配對(duì)列聯(lián)表的形式總結(jié)兩種試劑的定性檢測(cè)結(jié)果，分別計(jì)算全部樣本的陽性符合率、陰性符合率和總符合率以及IHC檢測(cè)結(jié)果為HER2（2+）樣本的陽性符合率、陰性符合率和總符合率。應(yīng)選擇合適的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)或推斷方法（如95%置信區(qū)間），給出不確定樣本占全部樣本的比例，并評(píng)價(jià)其對(duì)符合率的影響，以檢驗(yàn)兩種試劑檢測(cè)結(jié)果的一致性。

4.1.2由于此類試劑在臨床結(jié)果的報(bào)告中同時(shí)報(bào)告腫瘤細(xì)胞HER2基因平均拷貝數(shù)、腫瘤細(xì)胞CEP17平均拷貝數(shù)（雙探針適用）和兩者的比值（雙探針適用），因此還應(yīng)對(duì)拷貝數(shù)的準(zhǔn)確性進(jìn)行評(píng)價(jià)?？刹捎迷囼?yàn)用體外診斷試劑（考核試劑）與對(duì)比試劑或參考方法檢測(cè)結(jié)果的腫瘤細(xì)胞HER2基因平均拷貝數(shù)和腫瘤細(xì)胞CEP17平均拷貝數(shù)（雙探針適用）做散點(diǎn)圖的方法，配合適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)分析方法，如以線性回歸為基礎(chǔ)的分析方法或Bland-Altman方法等，評(píng)價(jià)考核試劑與對(duì)比試劑對(duì)于腫瘤細(xì)胞HER2基因平均拷貝數(shù)和腫瘤細(xì)胞CEP17平均拷貝數(shù)（雙探針適用）檢測(cè)結(jié)果的一致性。

4.2對(duì)臨床試驗(yàn)中人群基本特征進(jìn)行分析，包括：年齡、性別、病理組織類型、癌癥分期情況、免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果等（見表1）。

4.3聯(lián)合藥物評(píng)價(jià)臨床試驗(yàn)部分

可采用前瞻性或回顧性研究方法，結(jié)合接受藥物治療后的臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)等，分析檢測(cè)結(jié)果。此部分研究通常使用Kaplan Meier曲線等生存數(shù)據(jù)分析方法，選取適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)方法檢驗(yàn)客觀有效率，評(píng)價(jià)檢測(cè)結(jié)果與用藥后臨床結(jié)局之間的相關(guān)性。樣本數(shù)量應(yīng)符合統(tǒng)計(jì)學(xué)要求。

5.結(jié)果差異樣本的驗(yàn)證

在數(shù)據(jù)收集過程中，對(duì)兩種試劑檢測(cè)結(jié)果不一致的樣本，應(yīng)采用第三方試劑或其他合理的方法進(jìn)行復(fù)核，同時(shí)結(jié)合組織病理學(xué)特征、免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果等對(duì)差異產(chǎn)生原因進(jìn)行分析。

6.質(zhì)量控制

由于檢測(cè)前預(yù)處理步驟較多，導(dǎo)致判讀結(jié)果可能會(huì)在試驗(yàn)人員間、實(shí)驗(yàn)室間產(chǎn)生差異。為了客觀單一評(píng)價(jià)試劑性能，盡量減少這種人為差異對(duì)最終結(jié)果造成的影響，臨床試驗(yàn)開始前，各臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)應(yīng)統(tǒng)一操作方法，進(jìn)行判讀一致性訓(xùn)練及統(tǒng)一的質(zhì)量控制，確保同樣的樣本在不同機(jī)構(gòu)之間的判讀結(jié)果保持一致。注意應(yīng)包含IHC以及FISH檢測(cè)結(jié)果為陰性、陽性和不確定的樣本。該預(yù)評(píng)估內(nèi)容、實(shí)現(xiàn)方法、結(jié)果等應(yīng)在臨床試驗(yàn)報(bào)告中體現(xiàn)。

7.原始數(shù)據(jù)

7.1提交病例報(bào)告表（Case Report Form，CRF），內(nèi)容應(yīng)至少包括：性別、年齡、標(biāo)本的采集部位、標(biāo)本類型、病理診斷結(jié)果（包含分級(jí)）、HE染色結(jié)果、免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果、考核試劑檢測(cè)結(jié)果、對(duì)比試劑檢測(cè)結(jié)果、第三方復(fù)核結(jié)果。所有采用原位雜交法的檢測(cè)結(jié)果均應(yīng)包含評(píng)估的細(xì)胞數(shù)量、HER2基因/CEP17熒光信號(hào)比值（雙探針適用）、每個(gè)細(xì)胞的平均HER2拷貝數(shù)、每個(gè)細(xì)胞的平均CEP17拷貝數(shù)（雙探針適用）和定性判讀結(jié)果。

7.2提交入選樣本結(jié)果的代表性彩色圖片。

8.臨床試驗(yàn)總結(jié)報(bào)告撰寫

根據(jù)《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》的要求，臨床試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)對(duì)試驗(yàn)的整體設(shè)計(jì)及各個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)給予清晰、完整的闡述，應(yīng)對(duì)整個(gè)臨床試驗(yàn)實(shí)施過程、結(jié)果分析、結(jié)論等進(jìn)行條理分明的描述，并應(yīng)包括必要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)分析方法。建議在臨床試驗(yàn)總結(jié)報(bào)告中對(duì)以下內(nèi)容進(jìn)行詳述：

8.1臨床試驗(yàn)總體設(shè)計(jì)及方案描述

8.1.1臨床試驗(yàn)的整體管理情況、臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)選擇、臨床主要試驗(yàn)人員的選擇、人員簡(jiǎn)介等基本情況介紹；

8.1.2病例納入/排除標(biāo)準(zhǔn)、標(biāo)本的選擇例數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)；

8.1.3樣本類型，樣本的收集、處理及保存等；

8.1.4陰、陽性判讀標(biāo)準(zhǔn)、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法、統(tǒng)計(jì)軟件、評(píng)價(jià)統(tǒng)計(jì)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)及樣本量確定依據(jù)。

8.2臨床試驗(yàn)具體情況

8.2.1試驗(yàn)用體外診斷試劑和對(duì)比試劑的名稱、批號(hào)、有效期等信息；

8.2.2對(duì)各臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的病例數(shù)、人群分布情況進(jìn)行總合，建議以列表或圖示方式給出具體例數(shù)及百分比；

8.2.3質(zhì)量控制，試驗(yàn)人員培訓(xùn)、質(zhì)控片的檢測(cè)情況，對(duì)檢測(cè)結(jié)果判讀的抽查結(jié)果評(píng)估；

8.2.4具體試驗(yàn)過程，樣本檢測(cè)、數(shù)據(jù)收集、樣本保存、結(jié)果不一致樣本的驗(yàn)證等。

8.3臨床試驗(yàn)結(jié)果及分析

8.3.1數(shù)據(jù)預(yù)處理、差異結(jié)果的重新檢測(cè)或采用其他合理的方法進(jìn)行復(fù)核及無法評(píng)估樣本的處理、試驗(yàn)過程中是否涉及對(duì)方案的修改。

8.3.2結(jié)果的一致性分析

計(jì)算陽性符合率、陰性符合率、總體符合率及其95%（或99%）的置信區(qū)間。采用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)方法，對(duì)定性結(jié)果的檢測(cè)一致性和拷貝數(shù)檢測(cè)一致性進(jìn)行評(píng)價(jià)。采用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)聯(lián)合藥物臨床評(píng)價(jià)部分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行分析評(píng)價(jià)，研究檢測(cè)結(jié)果與用藥后臨床結(jié)局之間的相關(guān)性（如適用）。

8.4討論和結(jié)論

對(duì)整體結(jié)果進(jìn)行總結(jié)性描述并簡(jiǎn)要分析試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)本次臨床試驗(yàn)的特別說明（如有），最后得出臨床試驗(yàn)結(jié)論。

（八）產(chǎn)品技術(shù)要求

申請(qǐng)人應(yīng)當(dāng)在原材料質(zhì)量和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的前提下，根據(jù)產(chǎn)品研制、臨床評(píng)價(jià)等結(jié)果，依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)文獻(xiàn)，編寫產(chǎn)品技術(shù)要求。需符合《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導(dǎo)原則》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第9號(hào)）的要求。

產(chǎn)品性能指標(biāo)主要包括：外觀、熒光信號(hào)強(qiáng)度、靈敏度、特異性、陽性符合率、陰性符合率等。如果申報(bào)試劑已有適用的國(guó)家參考品/標(biāo)準(zhǔn)品發(fā)布，則申請(qǐng)人應(yīng)在產(chǎn)品技術(shù)要求中提出檢測(cè)要求。另外，產(chǎn)品技術(shù)要求中應(yīng)以附錄形式明確主要原材料、生產(chǎn)工藝及半成品要求，需符合相關(guān)編寫規(guī)范的要求。

（九）產(chǎn)品說明書

產(chǎn)品說明書承載了產(chǎn)品預(yù)期用途、檢測(cè)方法及檢測(cè)結(jié)果解釋等重要信息，是指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室工作人員正確操作、臨床醫(yī)生針對(duì)檢測(cè)結(jié)果給出合理醫(yī)學(xué)解釋的重要依據(jù)，是體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)最重要的文件之一。產(chǎn)品說明書的格式應(yīng)符合《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第17號(hào)）的要求。

結(jié)合《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》的要求，以下詳細(xì)說明書的重點(diǎn)內(nèi)容，以指導(dǎo)注冊(cè)申報(bào)人員更合理地完成說明書編制。

1.【預(yù)期用途】

應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：

1.1試劑盒用于體外定性檢測(cè)經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林固定石蠟包埋乳腺癌和/或胃癌組織切片中HER2基因的擴(kuò)增情況。用于指導(dǎo)乳腺原發(fā)性浸潤(rùn)癌和/或胃及胃食管結(jié)合部腺癌的藥物治療和/或預(yù)后評(píng)估（預(yù)后評(píng)估僅乳腺癌適用）。

1.2明確目標(biāo)人群：例如對(duì)所有乳腺原發(fā)性浸潤(rùn)癌原發(fā)灶、復(fù)發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶（如可以獲取到足夠的樣本）所有經(jīng)病理診斷證實(shí)為胃及胃食管結(jié)合部腺癌，新輔助治療后病灶及復(fù)發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶（如可以獲取到足夠的樣本）進(jìn)行檢測(cè)。因腫瘤個(gè)體化診療研究和發(fā)展不斷深入，該目標(biāo)人群可能隨著個(gè)體化治療藥物和試劑的研究和發(fā)展而發(fā)生變化，建議申請(qǐng)人參照最新指南或?qū)＜夜沧R(shí)設(shè)定申報(bào)產(chǎn)品的目標(biāo)人群。

1.3簡(jiǎn)單介紹HER2基因的生物學(xué)特征，如基本結(jié)構(gòu)、編碼蛋白及與腫瘤預(yù)后判斷、用藥指導(dǎo)的關(guān)系。

1.4簡(jiǎn)單介紹與IHC檢測(cè)之間的關(guān)系。建議說明臨床應(yīng)用過程中首先考慮使用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)HER2蛋白的過表達(dá)狀態(tài)，在結(jié)果為（2+）的情況下需進(jìn)一步應(yīng)用原位雜交方法確定HER2基因的擴(kuò)增狀態(tài)。

1.5如未進(jìn)行聯(lián)合藥物評(píng)價(jià)臨床試驗(yàn)，則不應(yīng)體現(xiàn)具體藥物產(chǎn)品（商品）名稱、生產(chǎn)企業(yè)信息等，并注明該產(chǎn)品未與具體藥物聯(lián)合進(jìn)行臨床評(píng)價(jià)。

1.6明確說明該試劑盒僅用于對(duì)特定腫瘤患者HER2基因擴(kuò)增情況的檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果僅供臨床參考，不應(yīng)作為患者個(gè)體化治療的唯一依據(jù)，臨床醫(yī)生應(yīng)結(jié)合患者病情、藥物適應(yīng)癥、治療反應(yīng)及其他實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)等因素對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行綜合判斷。

2.【檢測(cè)原理】

簡(jiǎn)述熒光原位雜交技術(shù)的基本原理。對(duì)特異性結(jié)合靶基因，探針長(zhǎng)度、序列設(shè)計(jì)、標(biāo)記染料名稱及標(biāo)記方法，預(yù)處理、雜交與復(fù)染過程，熒光信號(hào)觀察、計(jì)數(shù)和比值計(jì)算的方法等內(nèi)容進(jìn)行介紹。

3.【主要組成成分】

3.1說明試劑盒包含組分的名稱、數(shù)量、比例或濃度等信息；質(zhì)控片（如有）的組織或細(xì)胞株名稱。

3.2對(duì)檢測(cè)中使用的探針信息進(jìn)行簡(jiǎn)單介紹。

3.3試劑盒中不包含但對(duì)該項(xiàng)檢測(cè)必需的組分，應(yīng)列出相關(guān)試劑、質(zhì)控片（如適用）的名稱與貨號(hào)；耗材的規(guī)格（材質(zhì)）要求；化學(xué)制劑的純度和濃度（如適用）要求及其他相關(guān)信息。

4.【儲(chǔ)存條件及有效期】

對(duì)試劑的儲(chǔ)存條件、有效期、開封穩(wěn)定性、運(yùn)輸穩(wěn)定性和凍融次數(shù)限制等信息做詳細(xì)介紹。如試劑盒包含質(zhì)控片還應(yīng)在此處明確質(zhì)控片的穩(wěn)定性。

5.【適用儀器】

明確配套適用熒光顯微鏡的配置要求，至少包括對(duì)目鏡與物鏡的放大倍率、光源及濾光片要求。對(duì)顯微鏡配套耗材（如鏡油）的要求進(jìn)行介紹。

6.【樣本要求】

重點(diǎn)明確以下內(nèi)容：

6.1對(duì)適用樣本的取材、固定、包埋與切片的具體要求。此部分內(nèi)容可參考國(guó)際或國(guó)內(nèi)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)操作性文件內(nèi)容進(jìn)行編寫或引用。注意不同組織類型的樣本應(yīng)分別描述。

6.2樣本的穩(wěn)定性（包括蠟塊與切片）。

7.【檢測(cè)方法】

詳細(xì)說明操作的各個(gè)步驟：

7.1明確檢測(cè)需要的儀器與設(shè)備。如烤片機(jī)、恒溫箱、水浴鍋、染色缸、雜交盒等。注明貨號(hào)及生產(chǎn)商（如需要）。

7.2試劑配制方法、注意事項(xiàng)，試劑開封、配制后使用方法及注意事項(xiàng)等。

7.3對(duì)于手工或半自動(dòng)檢測(cè)，詳述脫蠟、煮片、消化、固定、核酸變性、雜交、洗滌和復(fù)染等各操作步驟。描述應(yīng)盡量細(xì)化，需明確各步驟處理時(shí)間、溫度、注意事項(xiàng)（如避光）等內(nèi)容。

7.4對(duì)雜交后載玻片的儲(chǔ)存及穩(wěn)定性、復(fù)染后的儲(chǔ)存及穩(wěn)定性進(jìn)行說明。

7.5詳細(xì)說明質(zhì)量控制情況：

建議實(shí)驗(yàn)室每次檢測(cè)設(shè)置內(nèi)對(duì)照和外對(duì)照（質(zhì)控片），以對(duì)整體操作流程進(jìn)行質(zhì)量控制。評(píng)價(jià)指標(biāo)應(yīng)包括細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性，探針雜交信號(hào)的強(qiáng)度和位點(diǎn)的準(zhǔn)確性，背景熒光強(qiáng)度，可計(jì)數(shù)信號(hào)（單色/雙色）的細(xì)胞占全部細(xì)胞的比例等。

7.5.1內(nèi)對(duì)照可為癌旁正常組織，明確樣本檢測(cè)的內(nèi)對(duì)照使用原則，如“75%以上的腫瘤細(xì)胞核中都有雜交信號(hào)時(shí)，視為檢測(cè)成功?！?/p>

7.5.2外對(duì)照可選擇已知HER2基因擴(kuò)增狀態(tài)的組織切片或者細(xì)胞株，至少包括臨界值以及無擴(kuò)增樣本。明確每一批次患者樣本檢測(cè)和更換使用新的試劑盒批次時(shí)，均應(yīng)同時(shí)進(jìn)行質(zhì)控片檢測(cè)，以監(jiān)控檢測(cè)性能并評(píng)估信號(hào)計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。分析質(zhì)控結(jié)果不符合要求的原因并詳述處理方式。

如試劑盒內(nèi)不包含質(zhì)控片，應(yīng)明確配套使用的質(zhì)控片信息，可以為商用質(zhì)控片也可以為臨床檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室自制質(zhì)控片。自制質(zhì)控片應(yīng)為已知FISH結(jié)果的陰性和陽性質(zhì)控片，詳述質(zhì)控片的制備方法。明確質(zhì)控結(jié)果要求（試驗(yàn)有效性的判斷），結(jié)果允許范圍（如適用于不同的儀器或適用于手工與儀器方法，應(yīng)分別列明結(jié)果的允許范圍）。

7.6建議強(qiáng)調(diào)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)相關(guān)的儀器設(shè)備需定期維護(hù)、校驗(yàn)，應(yīng)建立完善的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范文件，從事檢測(cè)的技術(shù)人員和病理醫(yī)師應(yīng)通過必要的培訓(xùn)和資格考核，做好記錄和存檔，內(nèi)部定期對(duì)不同批次檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行重復(fù)性分析；并積極參加相關(guān)的外部質(zhì)控活動(dòng)。

8.【陽性判斷值】

根據(jù)相關(guān)指南及規(guī)范性文件，以HER2拷貝數(shù)平均值/細(xì)胞和/或HER2總拷貝數(shù)與CEP17總拷貝數(shù)的比值（雙信號(hào)）的形式明確陽性判斷值。

9.【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

9.1從細(xì)胞核形態(tài)、探針信號(hào)強(qiáng)度、背景情況等多方面，詳述雜交后樣本玻片的有效性評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。建議對(duì)不符合有效性評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)情況發(fā)生時(shí)的常見問題及解決方法以列表的形式明確。

9.2明確目標(biāo)區(qū)域的確定方法及僅對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)的要求；明確細(xì)胞計(jì)數(shù)的具體方法，包括每個(gè)樣本初始讀取細(xì)胞數(shù)及結(jié)果不確定樣本的處理方法。明確HER2擴(kuò)增異質(zhì)性的處理方法。

可以列表的形式詳述信號(hào)計(jì)數(shù)與陰陽性判定規(guī)則，應(yīng)配合清晰彩圖圖例。例如對(duì)于浸潤(rùn)性乳腺癌，描述為“找到至少2個(gè)浸潤(rùn)癌區(qū)域，隨機(jī)計(jì)數(shù)至少20個(gè)浸潤(rùn)癌細(xì)胞核中的雙色信號(hào)，計(jì)算信號(hào)比值（比值=計(jì)數(shù)細(xì)胞核中紅色信號(hào)總數(shù)/計(jì)數(shù)細(xì)胞核中綠色信號(hào)總數(shù)），根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)對(duì)樣本進(jìn)行HER2基因擴(kuò)增陰陽性的判斷：比值≥2.0，或者比值<2.0且平均HER2拷貝數(shù)/CEP17拷貝數(shù)≥6.0時(shí)為陽性；擴(kuò)增細(xì)胞應(yīng)均質(zhì)、連續(xù)，且占浸潤(rùn)癌的10％以上。比值<2.0且平均HER2拷貝數(shù)/細(xì)胞<4.0時(shí)為陰性。HER2/CEPl7比值<2.0且平均HER2拷貝數(shù)/細(xì)胞<6.0，但≥4.0時(shí)為不確定。對(duì)于不確定的樣本，需再計(jì)算20個(gè)細(xì)胞核中的信號(hào)，或由另一閱片人重新計(jì)數(shù)。”

10.【檢驗(yàn)方法的局限性】

綜合產(chǎn)品的預(yù)期用途、臨床背景、檢測(cè)方法及適用范圍等信息，對(duì)可能出現(xiàn)的局限性進(jìn)行相關(guān)說明，主要包括以下描述，請(qǐng)申請(qǐng)人選擇適用的條款在產(chǎn)品說明書中予以闡述。

10.1本試劑盒為體外診斷試劑，檢測(cè)結(jié)果的臨床判定均應(yīng)結(jié)合患者醫(yī)療病史和其他臨床診斷結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)估，不得作為臨床診治的唯一依據(jù)。

10.2腫瘤組織HER2基因表達(dá)的異質(zhì)性可能影響檢測(cè)結(jié)果。例如可導(dǎo)致IHC與ISH檢測(cè)、原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶、活檢標(biāo)本與手術(shù)切除標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果不一致。異質(zhì)性在胃癌中更常見。對(duì)于胃鏡活檢標(biāo)本，多點(diǎn)活檢有助于減少腫瘤異質(zhì)性的影響，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。另外，新輔助治療會(huì)影響胃癌HER2狀態(tài)，治療前活檢標(biāo)本和治療后手術(shù)標(biāo)本的綜合判斷有助于更好的用藥指導(dǎo)。

10.3本試劑盒檢測(cè)結(jié)果受樣本來源、樣本采集過程、樣本質(zhì)量、樣本運(yùn)輸條件、樣本預(yù)處理等因素影響。同時(shí)由于結(jié)果判斷的主觀性，可能導(dǎo)致得出假陽性或假陰性的檢測(cè)結(jié)果，使用者應(yīng)了解檢測(cè)過程中可能存在的潛在錯(cuò)誤導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確等局限性。

10.4檢測(cè)結(jié)果如與組織病理學(xué)特征不符，應(yīng)核實(shí)病理診斷或重新檢測(cè)。

10.5本產(chǎn)品的性能指標(biāo)是基于說明書所述檢測(cè)程序獲得，對(duì)該程序進(jìn)行更改，可能會(huì)改變?cè)摍z驗(yàn)的結(jié)果。

10.6本試劑僅對(duì)經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林固定石蠟包埋的組織進(jìn)行了驗(yàn)證（如適用），不得用于其他樣本類型或流式細(xì)胞檢測(cè)等其他用途。

11.【產(chǎn)品性能指標(biāo)】

根據(jù)分析性能評(píng)估研究結(jié)果，詳述以下性能指標(biāo)，包括研究方法和評(píng)估結(jié)果：

11.1靈敏度：在乳腺浸潤(rùn)癌/胃癌病例的組織樣本，以及癌旁正常組織或者良性疾病組織樣本中探針與目標(biāo)基因位點(diǎn)的結(jié)合效率。

11.2特異性：HER2和CEP17探針對(duì)目標(biāo)序列識(shí)別的特異性。

11.3陰、陽性符合率：在不同組織類型中HER2基因的檢出能力和準(zhǔn)確性。

11.4精密度：批內(nèi)、批間精密度及不同時(shí)間、地點(diǎn)、檢測(cè)系統(tǒng)（如適用）、人員之間的精密度。

11.5臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)總結(jié)。

12.【注意事項(xiàng)】

12.1有關(guān)試劑盒內(nèi)人源組分（如有）生物安全性的警告。

12.2有關(guān)實(shí)驗(yàn)操作中涉及試劑的安全性提示，包括對(duì)有毒有害物質(zhì)的防護(hù)及危險(xiǎn)物品的處理方法等。

12.3熒光染料在光照條件下容易淬滅。為降低該影響，對(duì)所有含熒光探針的溶液，包括雜交后樣本載玻片均應(yīng)盡量避免或者減少在光照條件下保存和處理。

12.4使用校準(zhǔn)過的溫度計(jì)測(cè)定溶液、水浴槽和溫箱溫度。

三、編寫單位

國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心。