腫瘤相關(guān)突變基因檢測試劑（高通量測序法）性能評價通用注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則（2019年第83號）

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腫瘤相關(guān)突變基因檢測試劑（高通量測序法）性能評價通用注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊申請人對腫瘤相關(guān)基因檢測試劑分析性能評價注冊申報資料的準(zhǔn)備及撰寫，同時也為技術(shù)審評部門對注冊申報資料的技術(shù)審評提供參考。

本指導(dǎo)原則是針對腫瘤相關(guān)基因檢測試劑分析性能評價的一般要求，申請人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對注冊申報資料的內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和細(xì)化。

本指導(dǎo)原則是對申請人和審查人員的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但需要詳細(xì)闡明理由，并對其科學(xué)合理性進(jìn)行驗(yàn)證，提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料，相關(guān)人員應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時進(jìn)行調(diào)整。

一、適用范圍

本指導(dǎo)原則所述腫瘤相關(guān)基因檢測試劑分析性能評價主要是指基于高通量測序（high-throughput sequencing）即下一代測序（next generation sequencing，NGS），又稱為大規(guī)模平行測序（massively parallel sequencing，MPS），體外檢測人體組織腫瘤細(xì)胞中的腫瘤相關(guān)基因變異。用于檢測體細(xì)胞突變的NGS正在廣泛用于腫瘤診療相關(guān)的分子檢測，包括對特定基因的DNA/RNA進(jìn)行測序，以尋找與腫瘤臨床診療相關(guān)的基因變異。腫瘤基因突變類型包括點(diǎn)突變、插入、缺失、基因重排、拷貝數(shù)異常等廣義的基因突變。

基于NGS測序原理的體外診斷（In Vitro Diagnosis，IVD）檢測可能包括以下步驟：樣本收集、處理和保存、核酸提取及處理、文庫制備、測序和堿基識別、序列比對、變異識別和過濾、變異注釋和解讀以及檢測報告的生成。同時，某些產(chǎn)品還可能會包括軟件部分，但上述相關(guān)步驟并不一定被全部包括，應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品的具體設(shè)計流程來進(jìn)行判斷。對于每個檢測步驟，申請人需要結(jié)合產(chǎn)品設(shè)計和臨床意義來建立特定的可接受的質(zhì)量評價指標(biāo)和合格判斷標(biāo)準(zhǔn)。此外，為滿足產(chǎn)品特定預(yù)期用途，申請人需通過科學(xué)和適當(dāng)?shù)臋z測性能研究來確定適用的試劑、消耗品、儀器和軟件?；谏鲜隹紤]因素，NGS檢測產(chǎn)品的設(shè)計和工作流程中的任何差異均可能導(dǎo)致結(jié)果的不同，因此申請人需要清楚地描述相關(guān)檢測性能指標(biāo)。

分析性能評價的初衷在于提出產(chǎn)品性能有效性、安全性相關(guān)問題的假設(shè)，然后通過研究進(jìn)行確認(rèn)。NGS在測序通量及發(fā)現(xiàn)未知基因變異方面具有優(yōu)勢，但是在NGS技術(shù)應(yīng)用需求及使用中存在包括相關(guān)臨床樣本收集處理、NGS檢測內(nèi)容、測序流程、數(shù)據(jù)分析、結(jié)果報告等各方面的挑戰(zhàn)。

本指導(dǎo)原則將重點(diǎn)關(guān)注實(shí)體瘤中檢測具有臨床意義的體細(xì)胞變異和確保高質(zhì)量的檢測結(jié)果。申請人應(yīng)以患者的利益為中心，充分整合臨床腫瘤學(xué)家對于精準(zhǔn)診治的觀點(diǎn)，并充分考慮在我國推廣應(yīng)用的可操作性。申請人可采用多樣化的靶向基因組合檢測。由靶向基因產(chǎn)生的信息可能會被用于診斷分類，指導(dǎo)治療決策，和/或?yàn)樘囟[瘤提供預(yù)后評價，不同產(chǎn)品包含的基因數(shù)量可能存在較大差異。

本指導(dǎo)原則適用于進(jìn)行首次注冊申報和相關(guān)許可事項變更的產(chǎn)品。本指導(dǎo)原則不適用于全外顯子檢測、腫瘤全基因組測序、從頭測序、游離DNA檢測、RNA直接測序、病原體微生物及宏基因組學(xué)測序、胚胎植入前檢測、疾病風(fēng)險（含遺傳風(fēng)險）評估與預(yù)測、直接面向消費(fèi)者測序及健康人群篩查。

二、NGS性能評價

（一）綜述資料

綜述資料主要包括產(chǎn)品預(yù)期用途、產(chǎn)品描述、有關(guān)生物安全性的說明、研究結(jié)果的總結(jié)評價以及同類產(chǎn)品上市情況介紹等內(nèi)容。

申請人在計劃開發(fā)一個有針對性的基因檢測試劑時，需確定其預(yù)期用途、待測基因數(shù)量、檢測突變位點(diǎn)或者突變類型，包括將要檢測的樣本類型、適用人群以及哪些類型的檢測信息將被評估和報告。還應(yīng)考慮影響檢測的設(shè)計、驗(yàn)證和質(zhì)量控制的其他因素，并在試劑組成說明書中詳細(xì)說明該產(chǎn)品包含的試劑組分及需要但未提供的試劑、設(shè)備及耗材。

作為IVD檢測一般原則，申請人應(yīng)首先定義申報產(chǎn)品的預(yù)期用途和檢測性能，產(chǎn)品的預(yù)期用途將直接影響檢測設(shè)計和檢測性能以及測序和/或報告的基因類型。申請人需要前瞻性地確定應(yīng)進(jìn)行的研究指標(biāo)（例如準(zhǔn)確性）以及每種研究指標(biāo)應(yīng)該滿足的標(biāo)準(zhǔn)。在設(shè)計和開發(fā)完成之后，驗(yàn)證研究其是否滿足預(yù)定義的性能。如果檢測不符合任何預(yù)定義的性能標(biāo)準(zhǔn)，則應(yīng)分析原因、重新驗(yàn)證或修改預(yù)定義的性能指標(biāo)。通過反復(fù)的設(shè)計、開發(fā)和驗(yàn)證，直到檢測滿足設(shè)定需求。在整個過程中申請人需要記錄所有研究方案、研究過程和結(jié)果以及每項研究設(shè)計的理由。建議申請人列出樣本處理、文庫制備、測序、生信分析等環(huán)節(jié)主要質(zhì)量控制參數(shù)。如文庫濃度及片段長度、堿基識別質(zhì)量值（Base Call Quality scores）、過濾后有效Reads數(shù)、有效測序深度（如經(jīng)過去重處理等）、符合最低測序深度和平均測序深度要求的區(qū)域（%）等。

申請人應(yīng)提供整個檢測流程的標(biāo)準(zhǔn)操作程序文件（Standard Operating Procedure，SOP），對NGS技術(shù)檢測全過程包括的樣本收集處理、文庫制備、測序、數(shù)據(jù)分析、結(jié)果報告等過程進(jìn)行描述。生物信息學(xué)分析方面描述和記錄數(shù)據(jù)處理和分析，包括變異識別、過濾和注釋的所有過程。明確所有要使用的軟件，包括來源（例如：內(nèi)部開發(fā)以及第三方）以及主要修改。建議以列表形式描述所有需要的軟件和/或數(shù)據(jù)庫名稱、版本及其功能。

（二）主要原材料的研究資料

NGS檢測過程主要包括樣本收集處理、文庫制備、測序、數(shù)據(jù)分析、結(jié)果報告等。

1.樣本收集處理（如適用）

樣本收集處理過程是保證樣本具有能如實(shí)反映患者體征的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。申請人需提交涉及樣本收集及處理相關(guān)試劑主要原材料信息，如樣本前處理試劑、樣本運(yùn)輸保存試劑、核酸提取試劑的主要組成成分等。

2.文庫制備及測序

測序文庫構(gòu)建及測序過程中所需試劑主要包含脫氧核糖核苷三磷酸、連接酶、聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、限制性內(nèi)切酶、引物、探針、接頭等；如為申請人自行研究的主要原材料，申請人應(yīng)對測序文庫構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)過程予以詳述；并提供對各主要原材料的功能性研究。并對制備完成的原料成品進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)以確認(rèn)其符合標(biāo)準(zhǔn)要求，且整個生產(chǎn)工藝應(yīng)穩(wěn)定可控。如為申請人外購的主要原材料，應(yīng)詳述每一種原材料外購方來源，提交外購方出具的每種原材料性能指標(biāo)及質(zhì)量控制資料，并詳述申請人對外購主要原材料的各指標(biāo)質(zhì)量要求以及確定該原材料作為本產(chǎn)品主要原材料的詳細(xì)依據(jù)。核酸類檢測試劑的包裝材料和耗材應(yīng)無脫氧核糖核酸酶（Deoxyribonuclease,DNase）和核糖核酸酶（Ribonuclease，RNase）污染。

3.生物信息分析及數(shù)據(jù)庫要求

NGS的數(shù)據(jù)分析流程或生物信息學(xué)流程一般可以分為堿基識別、序列比對、變異識別和變異注釋等。明確參考序列類型，不同突變類型可能需要開發(fā)不同的變異/突變檢測算法。其次，應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品設(shè)計類型提供軟件工具的范圍和所需的驗(yàn)證類型。如涉及數(shù)據(jù)庫使用，建議申請人提交數(shù)據(jù)庫的溯源信息、數(shù)據(jù)庫類型、完整性、實(shí)時性、維護(hù)以及分析軟件的版本、性能驗(yàn)證等資料。

4.參考品要求

內(nèi)部參考品是保證產(chǎn)品性能穩(wěn)定性以及檢測值可溯源的重要構(gòu)成之一。參考品研究應(yīng)包括原料選擇、制備過程、定值研究及評價指標(biāo)等。申請人應(yīng)對內(nèi)部陽性/陰性參考品的來源、基因序列設(shè)置等信息進(jìn)行驗(yàn)證，并提供參考品溯源過程的測量程序或參考方法的相關(guān)信息及詳細(xì)的驗(yàn)證資料。

具體要求如下：

4.1陽性參考品及陽性質(zhì)控品：

4.1.1陽性參考品

理想狀態(tài)下，陽性參考品應(yīng)當(dāng)包括對所申報產(chǎn)品每個基因型的質(zhì)控樣本。但考慮到基于NGS技術(shù)的可檢測基因數(shù)量較多，申請人應(yīng)結(jié)合產(chǎn)品預(yù)期用途、臨床意義及基因類型等因素進(jìn)行針對性和代表性的設(shè)計。

對于有明確腫瘤伴隨診斷相關(guān)的基因，應(yīng)考慮該類基因參考品設(shè)置的合理性和完整性，需包括伴隨診斷相關(guān)的全部熱點(diǎn)基因，建議采用臨床樣本或細(xì)胞系提取的核酸儲備液作為原料。

對于具有顯著臨床意義或潛在臨床意義的基因，應(yīng)考慮代表性問題，明確具有臨床診斷意義的基因類型及基因型中不同的變異類型。突變頻率、變異類型的選取應(yīng)具有代表性，包括不同外顯子，不同基因變異突變等。

如檢測編碼區(qū)較大且存在非熱點(diǎn)區(qū)域設(shè)計（如大于1M），建議在陽性參考品中考慮對檢測整體區(qū)域的靈敏度驗(yàn)證（主要關(guān)注SNV等），如混合的永生化正常人白細(xì)胞DNA儲存液等。

不同突變/變異的變異豐度及突變頻率，濃度范圍設(shè)置應(yīng)具有代表性并提供這樣設(shè)定的依據(jù)。陽性參考品的突變形式及拷貝數(shù)需采用有效方法進(jìn)行確認(rèn)，并明確接受標(biāo)準(zhǔn)。申請人在設(shè)計陽性參考品時可一并考慮檢測限參考品的設(shè)置及確認(rèn)方式，并提供相關(guān)的依據(jù)。

4.1.2陽性質(zhì)控品

模擬病人樣本的目標(biāo)核酸序列，并用于質(zhì)控整個檢測過程，包括核酸提取（如適用）、文庫構(gòu)建、測序和數(shù)據(jù)分析。目前陽性質(zhì)控檢測和分析過程應(yīng)與臨床樣本方式一致。

4.2陰性參考品及陰性質(zhì)控品

陰性參考品及陰性質(zhì)控品建議為正常臨床樣本的混合物或細(xì)胞系，應(yīng)明確不含有目標(biāo)區(qū)域腫瘤突變基因。

4.3精密度參考品

精密度參考品設(shè)置要求可參考陽性/陰性參考品。

4.4 PCR 試劑無模板質(zhì)控品（No Template Control，NTC）（如適用）

申請人應(yīng)根據(jù)申報產(chǎn)品特點(diǎn)設(shè)置NTC質(zhì)控品及檢測接受標(biāo)準(zhǔn)，監(jiān)測檢測過程中是否存在污染。

（三）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料

NGS檢測是一個復(fù)雜的工作流程，它由很多獨(dú)立步驟組合而成。一般而言，對于每個檢測組成部分，申請人應(yīng)建立其特定檢測的指標(biāo)和驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)。必須對NGS每個操作流程的性能表現(xiàn)進(jìn)行一個內(nèi)部的驗(yàn)證。每步流程都需要分別優(yōu)化到一個最佳經(jīng)驗(yàn)值，以此來綜合決定最佳的實(shí)驗(yàn)操作條件及各參數(shù)的設(shè)置。

1.應(yīng)能對反應(yīng)體系涉及到的基本內(nèi)容，如臨床樣本用量、試劑用量、反應(yīng)條件、質(zhì)控體系設(shè)置等，提供確切的依據(jù)，配制工作液的各種原材料及其配比應(yīng)符合要求。

2.主要生產(chǎn)工藝、反應(yīng)原理介紹。逆轉(zhuǎn)錄過程（如涉及）及最佳反應(yīng)體系的研究資料，包括酶濃度、引物/探針濃度、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleotide triphosphate，dNTP）濃度、陽離子濃度等。

3.申報產(chǎn)品如包含核酸分離/純化試劑，應(yīng)提交對核酸分離/純化過程進(jìn)行工藝優(yōu)化的研究資料。如包括但不限于核酸體積、質(zhì)量、濃度、純度及完整性等。核酸濃度、純度檢測方法包括但不限于熒光法等；核酸完整性檢測方法包括但不限于瓊脂糖凝膠法等。

（四）分析性能評估資料

分析性能評估是反映產(chǎn)品主要原材料選擇，生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系等多方面因素設(shè)置是否合理的客觀評價指標(biāo)。檢測試劑性能的研究方案應(yīng)結(jié)合產(chǎn)品的反應(yīng)原理，臨床預(yù)期用途，使用條件等綜合因素進(jìn)行設(shè)計。性能研究應(yīng)涵蓋產(chǎn)品研制階段對試劑盒進(jìn)行的所有性能驗(yàn)證的研究資料，包括具體研究方法、內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、統(tǒng)計分析等詳細(xì)資料。

本部分內(nèi)容將從NGS檢驗(yàn)流程中的質(zhì)量控制要求和主要性能指標(biāo)兩部分進(jìn)行闡述：

1.NGS檢驗(yàn)流程

檢測方法中，應(yīng)明確所有檢測要素（如儀器、軟件、消耗品、試劑）。確定設(shè)計方案和標(biāo)準(zhǔn)并詳細(xì)記錄設(shè)計研究過程。對于基于NGS的檢測的每個組成，應(yīng)該確定規(guī)范并記錄。記錄每個檢測組成對于關(guān)鍵因素（如覆蓋率、堿基質(zhì)量等）的局限性。確定并記錄基因組的檢測區(qū)域，包括基因和變異類型，如果關(guān)鍵的測序區(qū)域不符合最低性能要求（如最小覆蓋標(biāo)準(zhǔn)等），則應(yīng)修改檢測并重新驗(yàn)證以達(dá)到最低性能要求。同時，應(yīng)在產(chǎn)品說明書和/或標(biāo)簽中明確可能影響或限制產(chǎn)品檢測性能情形。

1.1樣本制備

申請人需考慮可接受檢測的樣本類型對檢測結(jié)果的影響，應(yīng)明確組織樣本采集標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)。用于腫瘤組織突變基因檢測的標(biāo)本，在進(jìn)行檢測前，須對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行評估。腫瘤細(xì)胞所占比例需達(dá)到后續(xù)檢測方法的要求。

在NGS檢測試劑的設(shè)計開發(fā)過程中，申請人應(yīng)對配套使用的核酸提取、分離、純化及富集試劑進(jìn)行驗(yàn)證并提供驗(yàn)證方案的依據(jù)，應(yīng)明確樣品質(zhì)量（包括但不限于核酸濃度、純度及完整性）的最低要求并進(jìn)行質(zhì)量控制。如分離/純化后的核酸儲備液質(zhì)量（如濃度范圍）不符合要求，應(yīng)重新取材或擴(kuò)大樣本量再進(jìn)行核酸分離/純化。

1.2測序文庫制備

文庫制備是產(chǎn)生特定大小范圍的DNA或cDNA片段的過程。文庫質(zhì)量非常重要，申請人應(yīng)建立文庫構(gòu)建濃度、文庫片段大小要求，文庫濃度檢測方法包括但不限于實(shí)時熒光定量PCR法；文庫片段大小檢測方法包括但不限于毛細(xì)管電泳法等。申請人應(yīng)關(guān)注不同測序平臺的性能特點(diǎn)，確保片段長度分布符合后續(xù)測序要求。如需要進(jìn)行片段化處理。申請人應(yīng)制定核酸序列片段化操作流程及質(zhì)量控制方案。對經(jīng)過片段化的核酸短序列的濃度及片段分布等參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。

文庫制備的關(guān)鍵步驟是在DNA片段的兩端連接測序接頭，接頭序列是一段人為設(shè)計的序列，包含用于測序過程的多個目的的多個序列組分。如啟動測序反應(yīng)的通用測序引物序列，用于PCR擴(kuò)增引物序列、錨定序列、索引（條形碼）序列等。如申請人采用自定義序列，應(yīng)提供設(shè)計依據(jù)及研究資料。加接頭可以是獨(dú)立的步驟，也可以在靶向序列富集過程中添加。申請人使用條碼或標(biāo)簽時，需充分驗(yàn)證并滿足測序的質(zhì)量要求，如測序深度、覆蓋度等條件。申請人應(yīng)報告有效的條碼或標(biāo)簽數(shù)量，并對每個條碼或標(biāo)簽的序列及其位置有詳細(xì)、清晰的記錄。

1.3測序及堿基讀取

目前可用的測序平臺具有不同的測序方法，包括聯(lián)合探針錨定聚合測序法、邊合成邊測序和離子半導(dǎo)體測序，以及不同的檢測方法。盡管技術(shù)性能相似，但平臺之間存在差異，特別是不同的DNA輸入量要求、不同的測序通量、運(yùn)行時間、測序讀長和不同的堿基識別技術(shù)。這些差異會影響儀器處理低質(zhì)量樣本的能力、檢測插入/缺失/融合等變異類型的能力以及樣本通量。

申請人應(yīng)根據(jù)所選用的測序平臺，選擇合適的參數(shù)指標(biāo)對測序質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)控，制定相應(yīng)的管理制度及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并明確失控情況下的糾正措施。申請人應(yīng)根據(jù)具體應(yīng)用情況，如測序區(qū)域的大小及序列特征等因素確定測序所需要的覆蓋度及深度。在測序過程中，申請人應(yīng)建立標(biāo)準(zhǔn)操作流程及質(zhì)量控制方案監(jiān)控整個測序過程中的測序質(zhì)量。

申請人應(yīng)描述清晰，如在確立測序深度時需要明確指出是平均測序深度還是最低測序深度；還需要說明測序數(shù)據(jù)類型，如原始測序數(shù)據(jù)（原始reads數(shù)）、過濾之后的高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)或去除重復(fù)之后的測序深度。

堿基識別是指識別一段基因序列片段每一個位點(diǎn)的核苷酸的過程。不同測序平臺具有不同的測序偏好性，可影響堿基讀取過程中的錯誤類型與比率。堿基讀取后，申請人應(yīng)對每個堿基讀取的質(zhì)量進(jìn)行評估。

1.4生物信息學(xué)分析

申請人應(yīng)對生物信息學(xué)分析流程有完整的記錄，建立完善的生物信息學(xué)分析軟件的版本控制方案。申請人應(yīng)建立生物信息學(xué)分析標(biāo)準(zhǔn)操作流程及質(zhì)量控制方案，保證測序數(shù)據(jù)的分析、解讀及報告的準(zhǔn)確性與嚴(yán)謹(jǐn)性。生物信息學(xué)分析流程應(yīng)描述清晰，包括每一步驟使用軟件的名稱、版本、參數(shù)設(shè)置要求，包括但不限以下指標(biāo)：說明檢查每個位點(diǎn)的堿基質(zhì)量值和每個讀段的平均質(zhì)量值，堿基的頻率分布，讀長分布及是否存在重復(fù)序列和人工序列的評價方法，以保證按照該流程生物信息學(xué)分析結(jié)果可復(fù)現(xiàn)。生物信息學(xué)分析應(yīng)至少報告具有明確臨床指導(dǎo)意義的結(jié)果。

生物信息學(xué)分析一般包括但不限于數(shù)據(jù)預(yù)處理、數(shù)據(jù)比對及質(zhì)控、變異識別和變異注釋。根據(jù)測序類型和檢測報告的變異類型選擇生物信息流程，并考慮變異識別和評估流程過程中的限制因素以及第三方生物信息學(xué)工具對整個生物信息流程的影響。

1.4.1數(shù)據(jù)預(yù)處理：申請人應(yīng)說明分析流程使用的軟件類型及數(shù)據(jù)預(yù)處理步驟。數(shù)據(jù)文件（如FASTQ格式文件）應(yīng)包含質(zhì)控參數(shù)，如每個位點(diǎn)堿基質(zhì)量值的控制參數(shù)、GC含量以及序列長度分布等。明確測序堿基質(zhì)量值（Base Call Quality，如質(zhì)量值Q值得分）的閾值。明確判定實(shí)驗(yàn)有效的符合堿基質(zhì)量值的最低百分比。如采用其他方法，應(yīng)提供研究資料及選擇依據(jù)。

1.4.2數(shù)據(jù)比對及質(zhì)控：申請人應(yīng)提供BAM （Sequence Alignment/Map）文件生成過程軟件類型，每個樣本數(shù)據(jù)參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)以及判定實(shí)驗(yàn)有效的最低接受標(biāo)準(zhǔn)。提供參考序列的選擇依據(jù)，如為特殊序列，應(yīng)提供采用該序列的依據(jù)。

1.4.3突變分析：根據(jù)申報產(chǎn)品可檢測的基因類型，申請人應(yīng)確認(rèn)軟件工具類型及選擇依據(jù)。明確不同基因類型質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)以及判定實(shí)驗(yàn)有效的最低接受標(biāo)準(zhǔn)。

1.4.4突變注釋：申請人應(yīng)提供每個突變預(yù)測的功能性作用以及臨床解釋注釋的形成過程及數(shù)據(jù)來源依據(jù)。

1.5軟件研究（如適用）

根據(jù)申報產(chǎn)品預(yù)期用途，可能存在一些軟件產(chǎn)品不包含在申報產(chǎn)品組成成分中，但生物信息分析過程中需要用到該軟件，則該軟件被視為檢測系統(tǒng)一部分，申請人應(yīng)提供該部分軟件相關(guān)適用性研究資料。

1.6 NGS數(shù)據(jù)的存儲、傳輸與共享（如適用）

用于儲存原始和經(jīng)過分析后的檢測結(jié)果。建議申請人提交數(shù)據(jù)存儲中心的安全性、穩(wěn)定性、維護(hù)與升級方案以及異常情況處置方案等資料。

1.7公共/內(nèi)部數(shù)據(jù)庫應(yīng)用（如適用）

如申報產(chǎn)品的測序結(jié)果需要借助公共/內(nèi)部數(shù)據(jù)庫進(jìn)行結(jié)果注釋或報告解讀，申請人需提供所使用的公共/內(nèi)部數(shù)據(jù)庫在產(chǎn)品檢測中起到的作用說明，公共/內(nèi)部數(shù)據(jù)庫類型、功能介紹、版本號、標(biāo)準(zhǔn)操作流程及質(zhì)量控制方案等。

2.主要性能指標(biāo)

分析性能驗(yàn)證包括通過一組預(yù)定義性能評價方式，以證明性能是否足以滿足其預(yù)期用途并符合預(yù)定義的性能標(biāo)準(zhǔn)。通常涉及是否符合統(tǒng)計學(xué)評價要求，或檢測是否存在與患者的疾病相關(guān)的變異等。

2.1分析性能用樣本設(shè)置要求

申請人應(yīng)提供用于評估各項性能研究的標(biāo)本數(shù)量和類型設(shè)定的依據(jù)。根據(jù)產(chǎn)品預(yù)期用途，樣本研究應(yīng)包括代表性變異和變異類型。研究應(yīng)考慮與檢測適應(yīng)癥相關(guān)的臨床意義區(qū)域，跨不同基因區(qū)域的變異、難以測序或難以比對的基因區(qū)域，人工混合嵌合體以及任何其他變異類型、檢測區(qū)域。例如：如果檢測旨在用于檢測和報告插入、缺失位點(diǎn)等，應(yīng)包括但不限于不同大小的基因片段、突變所在區(qū)域等。

應(yīng)在研究中使用含有與檢測適應(yīng)癥相關(guān)的臨床樣本，臨床樣本應(yīng)具有適當(dāng)?shù)拇硇裕_?？筛采w申報產(chǎn)品聲稱的臨床相關(guān)序列變異等。

2.2準(zhǔn)確性

2.2.1總體要求

準(zhǔn)確性包括對比檢測值與被檢測值之間一致性。對于基于NGS測序原理的檢測，通過與適當(dāng)?shù)膶Ρ确椒ū容^，如核酸測序或其他經(jīng)過驗(yàn)證的方法，評估申報產(chǎn)品準(zhǔn)確性能。根據(jù)檢測的性能指標(biāo)，準(zhǔn)確性研究應(yīng)包括代表性變異和變異類型驗(yàn)證（準(zhǔn)確性研究樣本要求詳見2.1分析性能用樣本設(shè)置要求）。

對于每種變異類型以及代表性臨床相關(guān)變異，應(yīng)考慮變異頻率。對于變異類型，為了確定檢測的變異類型以及檢測它們的測序區(qū)域（不管變異是否具有致病性），可以使用具有代表性的參考物質(zhì)或具有高置信度的樣本進(jìn)行研究。對于臨床相關(guān)的變異，準(zhǔn)確性計算包含使用基于臨床樣本的研究數(shù)據(jù)與臨床樣本相關(guān)的指標(biāo)。

準(zhǔn)確性研究中應(yīng)含有代表性臨床相關(guān)變異與檢測適應(yīng)癥的臨床樣本，以確保臨床相關(guān)序列變異被檢測和報告。準(zhǔn)確性評估如采用前瞻性臨床樣本時，收集和處理的方式應(yīng)與產(chǎn)品預(yù)期用途一致。如果前瞻性的臨床樣本不可用，則可以使用臨床相關(guān)區(qū)域中含有特定變異的凍存臨床樣本或人類細(xì)胞系樣本替代或補(bǔ)充研究。

根據(jù)待評價方法和對比方法對所有變異的檢測結(jié)果分別計算陽性符合率（Positive Percent Agreement，PPA）、陰性符合率（Negative Percent Agreement，NPA）、陽性預(yù)測值（Positive Predictive Value，PPV）。通過檢測評估的每種類型的變異，如單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Variant，SNV）、插入、結(jié)構(gòu)變異，和測序區(qū)域范圍（如高度同源、高度多態(tài)或其他困難的區(qū)域），分別計算PPA、NPA等。

表1注：PPA通過將A（真陽性結(jié)果數(shù)）除以（A+C）、NPA通過將D（真陰性結(jié)果數(shù)）除以（B+D）。這些計算不應(yīng)包含任何無應(yīng)答或無效應(yīng)答，無應(yīng)答或無效應(yīng)答結(jié)果應(yīng)被單獨(dú)列出（見表2）。根據(jù)適用情況計算每種變體類型以及臨床相關(guān)變異PPA、NPA等。

表2注：準(zhǔn)確性研究中無應(yīng)答或無效應(yīng)答的百分比應(yīng)該被估計為（E + F）/ N以及95％的雙側(cè)置信區(qū)間。此外，應(yīng)評價陽性結(jié)果中的無應(yīng)答或無效應(yīng)答E /（A + C + E）和陰性結(jié)果中的無應(yīng)答或無效應(yīng)答F /（B + D + F）。申請人應(yīng)設(shè)定無應(yīng)答或無效應(yīng)答的最小可接受標(biāo)準(zhǔn)并提供依據(jù)。樣本總數(shù)（N = A + B + C + D + E + F）。申請人應(yīng)對無應(yīng)答或無效應(yīng)答產(chǎn)生原因進(jìn)行分析，注意區(qū)分無應(yīng)答或無效結(jié)果與模棱兩可結(jié)果，如質(zhì)控正常但結(jié)果無法識別的情況等。

2.2.2參考品準(zhǔn)確性

各水平、各突變位點(diǎn)的陽性參考品均應(yīng)按要求檢出陽性，考慮到濃度梯度或突變梯度的不同，應(yīng)對各水平陽性參考品設(shè)置相應(yīng)檢出要求；陰性參考品在各個引物探針組合的檢測條件下均應(yīng)檢出為陰性。

2.3檢測限

明確可接受的最低檢測限（Limit of Detection，LoD），并明確無效應(yīng)答或無應(yīng)答檢測結(jié)果的可接受標(biāo)準(zhǔn)。為預(yù)期用途中包含的每種變異類型建立LoD。如果檢測人工混合的樣本（如嵌合樣本），需要考慮不同的等位基因比率，確定檢測限。

試劑LoD的研究中應(yīng)在常規(guī)臨床實(shí)驗(yàn)室條件和確定的樣本類型下進(jìn)行。通常，LoD值采用分析物最低濃度計算得出，在此濃度下，可從相應(yīng)檢測重復(fù)中獲得至少95%的陽性檢出和可接受水平的無應(yīng)答或無效應(yīng)答。當(dāng)不同的變異類型可能具有不同的LoD時，需要計算不同的序列被測區(qū)域范圍中的每個變異類型的LoD。NGS檢測方法可以同時檢測多種類型突變基因，因此靈敏度的設(shè)置應(yīng)根據(jù)不同突變基因類型及判讀方式進(jìn)行驗(yàn)證。

2.4空白限（檢測基線）

應(yīng)確認(rèn)不會對報告區(qū)域的質(zhì)量分?jǐn)?shù)或覆蓋率產(chǎn)生負(fù)面影響。應(yīng)包含具有代表性的基因區(qū)域、變異類型和序列背景進(jìn)行驗(yàn)證研究。設(shè)置空白檢測限檢測標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)定評價方案及方法。

2.5分析特異性

分析特異性是評估產(chǎn)品僅可檢測到預(yù)期待測變異的能力。根據(jù)預(yù)期用途和產(chǎn)品設(shè)計，一些潛在的內(nèi)源性或外源性物質(zhì)干擾和交叉反應(yīng)或交叉污染可能會對產(chǎn)品檢測性能產(chǎn)生影響。

交叉反應(yīng)（如同源區(qū)域、假基因和其他類型的交叉反應(yīng)序列）可能導(dǎo)致錯誤檢測，從而產(chǎn)生假陽性結(jié)果?；颊邩?biāo)本的交叉污染可能將其他不正常的序列引入到檢測中，從而導(dǎo)致假陽性或假陰性結(jié)果。因此，應(yīng)選擇產(chǎn)品預(yù)期用途所覆蓋樣本或樣本類型以及DNA提取方法中相關(guān)的干擾物質(zhì)開展研究。同時，應(yīng)對已知交叉反應(yīng)的等位基因和同源區(qū)域進(jìn)行評估。

2.6精密度

精密度研究主要是指使用相同的樣本（包括檢測臨界值附近的樣本）在各種特定條件下進(jìn)行檢測（如不同操作員，不同操作條件，不同檢測天數(shù)，不同儀器等），并考慮檢測中主要的變異來源。申請人應(yīng)評估變異和野生型基因的精密度，其中應(yīng)分別報告不同檢測區(qū)域和變異類型的檢測值。申請人應(yīng)使用客觀證據(jù)和有效的統(tǒng)計方法來驗(yàn)證這些指標(biāo)設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)。

對可能導(dǎo)致檢測結(jié)果多樣性的主要因素進(jìn)行評價，包括但不限于檢測多個樣本、不同檢測批間、不同適用機(jī)型、試劑批次、檢測天數(shù)和操作員。

此外，申請人應(yīng)考慮外部因素相同的情況下，應(yīng)進(jìn)行申報試劑在相同或相似被測物的重復(fù)性檢測以評價檢測結(jié)果。申請人需對每個檢測條件和檢測區(qū)域下每個變異類型精密度分別進(jìn)行報告，還應(yīng)報告無應(yīng)答或無效應(yīng)答的百分比。

2.7體細(xì)胞與胚系突變鑒別研究（如適用）

申請人需提交資料明確申報產(chǎn)品如何有效鑒別胚系突變，申請人無論使用何種方法，都應(yīng)遵循保證準(zhǔn)確檢測的原則。如：對腫瘤樣本進(jìn)行檢測的同時對該患者正常配對樣本（正常癌旁組織或外周血白細(xì)胞）進(jìn)行檢測，根據(jù)配對樣本與癌組織樣本中鑒定出的突變信息進(jìn)行鑒別篩選，應(yīng)確認(rèn)樣本中特有的基因多態(tài)性，并明確混合后的每個多態(tài)性位點(diǎn)的預(yù)期頻率。當(dāng)無配對樣本時，申請人需提供如何有效區(qū)分體細(xì)胞突變和胚系突變鑒定標(biāo)準(zhǔn)并提供相關(guān)研究資料。

2.8批次互通性（如適用）

NGS的檢測通常包括試劑，消耗品，儀器和軟件。各部分相對獨(dú)立，申請人需對各批次之間是否互通進(jìn)行研究。

2.9生物分析流程的性能補(bǔ)充研究（如適用）

當(dāng)臨床樣本、細(xì)胞系或生物合成材料不可用或無法完全覆蓋生物分析流程時，可以使用含有各種要求類型的已知序列變異（如：SNV、插入、缺失、結(jié)構(gòu)變異等）的計算機(jī)構(gòu)建的序列標(biāo)本。申請人可采用軟件編輯滿足驗(yàn)證需要的模擬樣本或數(shù)學(xué)模型，對生物分析流程進(jìn)行補(bǔ)充驗(yàn)證。這些數(shù)據(jù)文件應(yīng)使用與申報產(chǎn)品相同的預(yù)分析和分析方法來生成。需要注意，編輯樣本不能替代生物學(xué)樣本，只能作為生物學(xué)樣本不能滿足所有驗(yàn)證條件下的補(bǔ)充情形。

2.10其他

評估檢測局限性時，申請人應(yīng)采用特殊樣本，如大于特定大小的插入或缺失或重排，并確定檢測無法以預(yù)期的準(zhǔn)確度和精確度檢測到的序列變化類型。如果這些區(qū)域是申報產(chǎn)品檢測預(yù)期用途的一部分，則需要驗(yàn)證高度同源、高度多態(tài)或其他困難區(qū)域的變異的檢測性能。如果被檢測的基因區(qū)域的一部分難以測序并且不能達(dá)到性能閾值，則應(yīng)該將其報告為檢測局限性。如適用，申請人應(yīng)記錄申報產(chǎn)品不會報告的檢測類型。

在設(shè)計和驗(yàn)證過程中，申請人應(yīng)記錄所有檢測失敗情況并分析原因。例如，由于未能滿足其一個或多個檢測運(yùn)行質(zhì)量指標(biāo)等。不符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的檢測區(qū)域不應(yīng)報告變異結(jié)果。由于未能達(dá)到檢測運(yùn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)而未被檢測到的區(qū)域，則應(yīng)如實(shí)報告。

申報產(chǎn)品上市后，通過上市后臨床數(shù)據(jù)收集和分析或藥品說明書中明確具有伴隨診斷用途的基因，在不改變原有反應(yīng)體系和檢測方式等情況，申請人可通過收集本產(chǎn)品臨床有效性資料申請變更其臨床用途。

三、名稱解釋

通量測序（High-throughput sequencing）：又稱下一代測序技術(shù)（Next-generation sequencing），可以一次性對數(shù)百萬條核酸分子進(jìn)行大規(guī)模平行測序。

全基因組測序：對某種生物基因組中的全部堿基進(jìn)行測序，即把細(xì)胞內(nèi)完整的基因組序列從第一個DNA分子開始直到最后一個DNA分子完整檢出，并按順序排列。

從頭測序（de novo sequencing）：即不依賴于任何已知的基因組參考序列和其他序列信息，而直接對某個物種的全基因組DNA進(jìn)行測序，然后利用生物信息學(xué)工具對下機(jī)序列進(jìn)行拼接和組裝，從而獲得該基因組的全序列或連續(xù)的大片段。

永生化正常人白細(xì)胞：將正常人的白細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，并通過基因轉(zhuǎn)染等技術(shù)將外源性永生化基因，如病毒、原癌基因和抑癌基因突變體等，導(dǎo)入目的細(xì)胞內(nèi)以增加永生化的發(fā)生率，從而得到的永生化細(xì)胞株。

變異豐度：變異基因型在所有基因型中所占的比例，計算方式為變異基因型數(shù)量除以野生型和變異型基因總量。

變異頻率：變異基因型在總?cè)巳褐械幕蝾l率。

原始reads數(shù)：經(jīng)過高通量測序后，測序下機(jī)數(shù)據(jù)總reads數(shù)。

有效測序深度（如經(jīng)過去重處理等）：去除PCR重復(fù)等后的平均深度。

符合最低測序深度和平均測序深度要求的區(qū)域（%）：最低測序深度和平均測序深度均大于閾值的區(qū)域數(shù)與區(qū)域總數(shù)的比值。

GC含量（GC content）：在測序所得的所有堿基中G（鳥嘌呤）和C（胞嘧啶）兩種堿基數(shù)與所有堿基數(shù)的比值。

覆蓋率：測序覆蓋區(qū)域占總目標(biāo)區(qū)域的比例。

最小覆蓋標(biāo)準(zhǔn)：測序覆蓋區(qū)域占總目標(biāo)區(qū)域的最小比例閾值。

堿基識別質(zhì)量值（base call quality scores）：衡量測序質(zhì)量的重要指標(biāo)，指測序得到的堿基的可靠性程度，基因的高通量測序中，每測一個堿基會給出一個相應(yīng)的質(zhì)量值（base call quality，Q），用于衡量測序準(zhǔn)確度。質(zhì)量值越高表示堿基識別越可靠，堿基被測錯的概率越小。

錨定序列：測序芯片上隨機(jī)分布的兩種不同的寡核苷酸序列，用于與測序文庫結(jié)合。

索引（條形碼）序列：index標(biāo)簽序列或barcode標(biāo)簽序列，指在文庫構(gòu)建過程中引入的一段標(biāo)簽序列，用于多樣品同時測序時區(qū)分不同樣本的序列。    

無應(yīng)答或無效應(yīng)答：測序結(jié)果失敗或測序數(shù)據(jù)低于質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果無效。

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五、起草單位

國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心。