呼吸道病毒多重核酸檢測試劑注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則（2019年第80號）

附件：呼吸道病毒多重核酸檢測試劑注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則（2019年第80號）.doc

呼吸道病毒多重核酸檢測試劑注冊技術(shù)
審查指導(dǎo)原則

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊申請人對呼吸道病毒多重核酸檢測試劑注冊申報資料的準(zhǔn)備及撰寫，同時也為技術(shù)審評部門審評注冊申報資料提供參考。

本指導(dǎo)原則是對呼吸道病毒多重核酸測定試劑的一般要求，申請人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對注冊申報資料的內(nèi)容進(jìn)行充實和細(xì)化。如申請人認(rèn)為有必要增加本指導(dǎo)原則未包含的研究內(nèi)容，可自行補充。

如果申報產(chǎn)品檢測項目包括的病毒有相應(yīng)的指導(dǎo)原則，應(yīng)首先滿足指導(dǎo)原則要求的內(nèi)容。

本指導(dǎo)原則是供申請人和審查人員使用的指導(dǎo)文件，不涉及注冊審批等行政事項，亦不作為法規(guī)強制執(zhí)行，如有能夠滿足法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但應(yīng)提供詳細(xì)的研究資料和驗證資料。應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)體系及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善和科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時進(jìn)行調(diào)整。

一、適用范圍

呼吸道感染（Respiratory tract infection，RTI）是人類最常見的一類疾病，可以在任何性別、年齡和地域中發(fā)生，是全球范圍內(nèi)引起人群發(fā)病和死亡的最主要原因之一。呼吸道感染引起的臨床癥狀和體征都較為相似，其臨床表現(xiàn)主要為鼻炎、咽炎、喉炎、扁桃體炎等癥狀，嚴(yán)重的可引起氣管炎、支氣管炎及肺炎等，但不同病原體引起的感染，其治療方法、療效和病程也不盡相同。目前已證明，大部分呼吸道疾病是由細(xì)菌外的病原體引起，其中以呼吸道病毒最常見。

本指導(dǎo)原則適用于呼吸道病毒多重核酸檢測試劑，適用樣本類型為鼻咽拭子、鼻拭子、咽拭子、肺泡灌洗液、痰液或其他呼吸道分泌物樣本等，可包括但不限于：

甲型流感病毒（Influenza A，IFV A）、乙型流感病毒（Influenza B，IFV B）、呼吸道合胞病毒（Respiratory Syncytial Virus，RSV）、副流感病毒(Parainfluenza Virus，PIV)、人偏肺病毒（Human Metapneumovirus，hMPV）、腺病毒（Adenovirus，Adv）、呼吸道感染腸道病毒（腸道病毒/鼻病毒）（Enterovirus，EV/ Rhinovirus， RhV）、冠狀病毒（Coronavirus，CoV）等。

本指導(dǎo)原則適用于利用熒光探針聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time PCR）或其他分子生物學(xué)方法，以特定的呼吸道病毒基因序列為檢測目標(biāo)，對來源于人體樣本中的呼吸道病毒核酸進(jìn)行體外定性檢測，臨床用于輔助診斷呼吸道病毒感染相關(guān)性疾病。涉及其他臨床用途的呼吸道病原體核酸檢測試劑可參考本指導(dǎo)原則。

二、注冊申報資料要求

（一）綜述資料

綜述資料主要包括產(chǎn)品預(yù)期用途、產(chǎn)品描述、有關(guān)生物安全性的說明、有關(guān)產(chǎn)品主要研究結(jié)果的總結(jié)和評價以及其他內(nèi)容，其中的其他內(nèi)容包括同類產(chǎn)品在國內(nèi)外批準(zhǔn)上市情況。與預(yù)期用途相關(guān)的臨床適應(yīng)癥應(yīng)重點描述呼吸道病毒型別與臨床適應(yīng)癥的相關(guān)性及相關(guān)病毒在我國的流行特征；產(chǎn)品描述應(yīng)明確申報產(chǎn)品所有可檢出的病毒型別、尚未驗證的病毒型別，陳述應(yīng)科學(xué)、客觀且有依據(jù)；與國內(nèi)外同類產(chǎn)品的比較內(nèi)容應(yīng)著重從方法學(xué)、病毒種類及基因型檢出能力、檢出限等方面進(jìn)行比較。應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊管理辦法》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局令第5號）和《體外診斷試劑注冊申報資料要求及說明》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局公告2014年第44號）的相關(guān)要求。

（二）主要原材料的研究資料

此類產(chǎn)品的主要原材料包括引物、探針、酶、dNTP、核酸分離/純化組分（如有）、企業(yè)參考品、質(zhì)控品等。應(yīng)提供主要原材料的選擇與來源、制備過程、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等相關(guān)研究資料、質(zhì)控品的定值試驗資料等。如主要原材料為企業(yè)自制，應(yīng)提供其詳細(xì)制備過程；如主要原材料源于外購，應(yīng)提供資料包括：選擇該原材料的依據(jù)及對比試驗資料、供貨方提供的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、出廠檢定報告，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗資料。

1.引物和探針：應(yīng)詳述引物和探針的設(shè)計原則，提供引物、探針核酸序列、模板核酸序列及兩者的對應(yīng)情況。建議每種病毒設(shè)計兩套或多套引物、探針以供篩選，針對所有預(yù)期適用的病毒種類及基因型別進(jìn)行檢出能力和特異性（如交叉反應(yīng)）的評價，選擇最佳組合，并提交篩選的研究數(shù)據(jù)。引物、探針的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)至少包括序列準(zhǔn)確性、純度、濃度及功能性實驗等。

如為外購，引物和探針應(yīng)提供合成機構(gòu)出具的質(zhì)檢證明，如純度（應(yīng)達(dá)到電泳級或HPLC級）、序列準(zhǔn)確性等，申請人應(yīng)對引物、探針核酸序列準(zhǔn)確性、純度、濃度、探針標(biāo)記的熒光素或化學(xué)發(fā)光物等進(jìn)行核實，同時申請人應(yīng)進(jìn)行功能性驗證，并提供相關(guān)資料。

2.脫氧三磷酸核苷（dNTP）：包括dATP、dUTP、dGTP、dCTP、dTTP，應(yīng)提供對其純度、濃度、功能性等的詳細(xì)驗證資料。

3.酶：需要的酶主要包括DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、尿嘧啶DNA糖基化酶等，應(yīng)分別對酶活性、功能性等進(jìn)行評價和驗證。DNA聚合酶，應(yīng)具有DNA聚合酶活性，無核酸內(nèi)切酶活性，具熱穩(wěn)定性；逆轉(zhuǎn)錄酶，具逆轉(zhuǎn)錄酶活性，無核酸內(nèi)切酶活性；尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG），應(yīng)對酶活性及熱穩(wěn)定性有合理驗證。

4.試劑盒內(nèi)質(zhì)控品

試劑盒的質(zhì)控體系通過設(shè)置各種試劑盒對照品（質(zhì)控品）來實現(xiàn)，其參與樣本核酸的平行提取，以對整個PCR反應(yīng)過程、試劑/設(shè)備、交叉污染等環(huán)節(jié)進(jìn)行合理質(zhì)量控制。質(zhì)控品濃度及成分的設(shè)置應(yīng)與待測樣本相近。申報資料應(yīng)對試劑盒對照品有關(guān)原料選擇、制備、定值過程、濃度范圍等試驗資料詳細(xì)說明。

4.1陰性質(zhì)控品應(yīng)不含試劑盒所檢測的靶序列，應(yīng)參與樣本處理和檢測的全過程。以對可能存在的交叉污染產(chǎn)生的假陽性結(jié)果或擴增反應(yīng)中背景值進(jìn)行質(zhì)量控制。陰性質(zhì)控品可來自非呼吸道病毒感染患者樣本、假病毒、含非靶向序列的生物樣本。建議采用與實際檢測樣本具有相同或相似性狀的基質(zhì)溶液作為陰性對照（質(zhì)控）品，不推薦采用水作為陰性對照（質(zhì)控）品。

4.2陽性質(zhì)控品

4.2.1全過程陽性質(zhì)控品應(yīng)參與樣本處理和檢測的全過程，如核酸的平行提取等步驟。全過程陽性質(zhì)控品可用1～2個病毒株為代表，應(yīng)含有天然的或人工合成的包含試劑盒可檢測靶序列，可來自滅活病毒、假病毒、疫苗株等。企業(yè)應(yīng)對質(zhì)控品的檢測結(jié)果（如Ct值）做出明確的范圍要求。

4.2.2擴增/檢測用陽性對照品（如有）可為濃度在最低檢出限附近的純化靶核酸，以對檢測過程進(jìn)行質(zhì)量控制。

4.3內(nèi)對照（內(nèi)標(biāo)）可以對管內(nèi)抑制導(dǎo)致的假陰性結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制，應(yīng)與靶核酸一同提取及擴增，申請人應(yīng)對內(nèi)對照（內(nèi)標(biāo)）的引物、探針設(shè)計和模板濃度做精確驗證，既要保證內(nèi)標(biāo)熒光通道呈明顯的陽性曲線又要盡量降低對靶基因檢測造成的抑制。對內(nèi)對照的檢測結(jié)果（如Ct值）亦應(yīng)做出明確的范圍要求。內(nèi)標(biāo)可設(shè)置為與待測病毒共提取的人核酸、人管家基因（如RNaseP、β-肌動蛋白）或人工合成的外源片段。

5.企業(yè)參考品：應(yīng)詳細(xì)提供有關(guān)企業(yè)參考品的原料選擇、制備、陰陽性確認(rèn)等試驗資料。企業(yè)參考品的核酸性質(zhì)應(yīng)與產(chǎn)品預(yù)期檢測的靶物質(zhì)一致。建議企業(yè)參考品優(yōu)先采用病毒培養(yǎng)物，如病毒難以培養(yǎng)，可采用假病毒、病毒株感染的細(xì)胞系等。

5.1陽性參考品和陰性參考品

陽性參考品應(yīng)覆蓋申報產(chǎn)品聲稱可檢出的主要呼吸道病毒亞型（詳見表1）。陰性參考品應(yīng)考慮檢測特異性的評價，應(yīng)納入不在試劑盒檢測范圍內(nèi)、易引發(fā)相似癥狀的其他呼吸道病原體樣品。

5.2檢測限參考品

申請人應(yīng)明確檢測限參考品中病毒核酸濃度的確定方法，明確檢測限參考品中病毒核酸濃度的確定依據(jù)，檢測限參考品中呼吸道病毒核酸濃度應(yīng)為申報產(chǎn)品檢測限濃度或略高于檢測限濃度，檢測限參考品應(yīng)包含申報產(chǎn)品可檢出的呼吸道病毒主要亞型（詳見表1）。

5.3精密度參考品

可不包含所有涉及的呼吸道病毒亞型，但應(yīng)選擇多個臨床較常見的型別，針對所選型別應(yīng)至少包含3個水平：陰性水平、臨界陽性水平、（中或強）陽性水平。

（三）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料

1.介紹產(chǎn)品主要生產(chǎn)工藝，可用圖表方式表示，并說明主要生產(chǎn)工藝的確定依據(jù)。

2.反應(yīng)原理介紹。

3.詳述樣本采集、樣本處理方式的選擇和設(shè)置，提供相關(guān)的研究資料。

4.確定最佳反應(yīng)體系的研究資料，包括樣本用量、各種酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度及反應(yīng)各階段溫度、時間、循環(huán)數(shù)等。

5.不同適用機型的反應(yīng)條件如果有差異應(yīng)分別詳述，并提交驗證資料。

6.如申報產(chǎn)品包含核酸分離/純化試劑，應(yīng)提交對核酸分離/純化過程進(jìn)行工藝優(yōu)化的研究資料。

（四）分析性能評估資料

申請人應(yīng)提交生產(chǎn)者在產(chǎn)品研制階段對試劑盒進(jìn)行的所有性能評價的研究資料，對于每項分析性能的評價都應(yīng)包括具體研究目的、試驗方法、可接受標(biāo)準(zhǔn)、試驗數(shù)據(jù)、統(tǒng)計方法等詳細(xì)資料。有關(guān)分析性能驗證的背景信息也應(yīng)在申報資料中有所體現(xiàn)，包括實驗地點、適用儀器、試劑規(guī)格、批號、臨床樣本來源等。

針對不同的樣本類型，申請人應(yīng)分別完成性能評估，包括陰陽性符合率、最低檢測限、精密度、分析特異性等。

分析性能評價的試驗方法可以參考國際或國內(nèi)有關(guān)體外診斷試劑性能評估的指導(dǎo)原則進(jìn)行。對于此類產(chǎn)品，性能評估中所用樣品（除非特別說明）可參考上述企業(yè)參考品的制備要求。各項性能評價應(yīng)符合以下要求：

1.核酸分離/純化性能

在進(jìn)行靶核酸檢測前，應(yīng)有適當(dāng)?shù)暮怂岱蛛x/純化步驟。該步驟的目的除最大量分離出目的核酸外，還應(yīng)有相應(yīng)的純化作用，盡可能去除PCR抑制物。無論檢測試劑是否含有核酸分離/純化的組分，企業(yè)都應(yīng)結(jié)合檢測試劑的特性，對配合使用的核酸分離/純化試劑的提取效率、提取核酸純度等做充分的驗證，提供詳細(xì)的驗證資料。

2.陽/陰性參考品符合率

陽性參考品的檢測旨在驗證試劑盒檢測范圍內(nèi)的各呼吸道病毒主要亞型均可被檢測到，陽性參考品檢測結(jié)果應(yīng)為陽性。陰性參考品旨在評價試劑特異性，陰性參考品檢測結(jié)果應(yīng)為陰性。

3.最低檢出限

申報產(chǎn)品最低檢測限的性能評估資料應(yīng)包含最低檢測限的確定及驗證過程。

病毒原液濃度測定建議采用空斑形成單位（PFU）或半數(shù)組織培養(yǎng)感染/致死劑量（TCID50）為計量單位（最低檢出限建議的病毒亞型見表1）。建議建立PFU/TCID50與拷貝數(shù)之間的關(guān)系。

企業(yè)應(yīng)能夠提供用于最低檢出限驗證的病毒株的來源、型別確認(rèn)及滴度確認(rèn)試驗等信息。

用于最低檢測限確定和驗證的病毒株如包括疫苗株，其應(yīng)能夠體現(xiàn)發(fā)病季的病毒特點。

3.1最低檢測限的確定

應(yīng)針對申報產(chǎn)品所能檢出的主要呼吸道病毒亞型分別進(jìn)行確定。在進(jìn)行最低檢測限的確定時，參與研究的病毒各亞型應(yīng)至少包括不同來源的2個具有代表性的病毒株的系列稀釋梯度。建議采用培養(yǎng)后病毒原液、以混合陰性樣本基質(zhì)作為稀釋液進(jìn)行梯度稀釋，難以培養(yǎng)的病毒也可采用假病毒或其他適宜方法進(jìn)行最低檢出限的確定。配制系列稀釋的樣品每個稀釋度上重復(fù)制備3～5份樣本，系列稀釋度應(yīng)能夠覆蓋大部分檢出概率區(qū)間（0～100%），可通過概率計算或其他適當(dāng)方法進(jìn)行測算選取適當(dāng)檢出率水平的濃度作為最低檢測限確定的標(biāo)準(zhǔn)，如90-95%（n≥20）的陽性檢出率水平。

通過另制備至少5份最低檢測限濃度水平的病毒稀釋液對90%～95%的檢出率進(jìn)行確認(rèn)。

3.2最低檢測限的驗證

申報試劑應(yīng)在最低檢出限或接近最低檢出限的病毒濃度、對每種常見待測病毒亞型具有時間和區(qū)域特征性的至少3個不同來源的病毒（病毒株或臨床樣本）進(jìn)行驗證，總測試數(shù)不少于20次。

4.包容性驗證

建議申請人在病毒LoD水平上或附近對聲稱樣本進(jìn)行分析，證明試驗?zāi)軌驒z測代表時間和地理多樣性的、每種病毒主要亞型至少3個不同來源的臨床樣本（推薦病毒亞型見表1）。包容性驗證所用臨床樣本與最低檢測限驗證的樣本不能重復(fù)使用。

企業(yè)應(yīng)能夠提供用于包容性驗證的病毒株的來源、型別確認(rèn)、滴度確定等信息。

5.干擾試驗（分析特異性）

在本項試驗中，申請人應(yīng)充分評估整個系統(tǒng)即從核酸提取到擴增的全過程的分析特異性。用于分析特異性驗證的樣本應(yīng)使用聲稱的樣本類型基質(zhì)，并包括每種申報的樣本類型。

5.1內(nèi)源/外源物質(zhì)干擾

應(yīng)根據(jù)所采集樣本類型，針對可能存在的干擾情況進(jìn)行驗證。建議申請人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度（“最差條件”）條件下進(jìn)行評價，并針對有代表性的呼吸道病毒亞型，在病毒臨界陽性水平進(jìn)行干擾試驗驗證。檢測的潛在干擾物包括樣本中的原有物質(zhì)（如血液、鼻腔分泌物或粘膜，及用于緩解淤血、鼻噪、刺激或哮喘和過敏癥狀的鼻腔和咽喉藥物）及在樣本采集和制備期間引入的物質(zhì)（推薦用于干擾性試驗的物質(zhì)見表2）。由于體外試驗不一定能完全反映藥物影響，在適用情況下可考慮替代性試驗如評估臨床實驗中所納入患者的用藥影響，因此申請人也應(yīng)評估其他常規(guī)或非處方藥物及其代謝物。

5.2競爭性干擾

申請人應(yīng)充分考慮臨床上常見的呼吸道病毒混合感染情況下（如甲型流感病毒與呼吸道合胞病毒），高濃度分析物對低濃度分析物檢測的影響。建議申請人結(jié)合申報試劑的反應(yīng)模式，使用一種最低檢測限濃度的分析物和一種高濃度分析物評估競爭性干擾，競爭性感染的病毒組合建議為同一反應(yīng)體系內(nèi)病毒、常見重癥感染病毒及常見混合感染病毒（如IFV A和RhV、IFV B和RhV、IFV A和PIV、EV和RhV、PIV和HRV、以及其他的多重感染等）。競爭性干擾試驗可與最低檢測限、重復(fù)性或其他干擾試驗同時進(jìn)行。

6.交叉反應(yīng)

6.1與試劑盒中其他病毒的交叉反應(yīng)性

建議申請人充分驗證試劑盒中可檢測病毒及亞型之間的交叉反應(yīng)性，應(yīng)使用病毒最高臨床水平濃度進(jìn)行。

6.2與不在試劑盒檢測范圍中的病原體的交叉反應(yīng)性

申請人應(yīng)針對可能出現(xiàn)在檢測樣本中的病原體（如采樣部位常見微生物、其他呼吸道感染病原體等）進(jìn)行交叉反應(yīng)驗證。用于交叉反應(yīng)驗證的樣品，應(yīng)盡量采用滅活病原體或臨床樣本。建議在病毒和細(xì)菌感染的醫(yī)學(xué)相關(guān)水平進(jìn)行交叉反應(yīng)的驗證，申請人應(yīng)詳細(xì)說明交叉反應(yīng)樣本來源、病原體鑒定和滴度確定的方法和結(jié)果。病原體種類主要考慮以下幾方面：試劑盒檢測范圍以外的其他呼吸道病原體、感染人群呼吸道樣本中的其他微生物（如EBV和CMV）、樣本中可能出現(xiàn)的其他病原體。

7.精密度

企業(yè)應(yīng)對精密度指標(biāo)，如標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)等的評價標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求。模擬樣本并不能體現(xiàn)臨床樣本可能帶來的所有變異因素，因此精密度評價中應(yīng)同時包含若干臨床樣本，且精密度評價試驗應(yīng)包含核酸分離/純化步驟。針對本類產(chǎn)品的精密度評價主要包括以下要求。

7.1對可能影響檢測精密度的主要變量進(jìn)行驗證，除檢測試劑（包括核酸分離/純化組分）本身的影響外，還應(yīng)對分析儀、操作者、地點、檢測輪次等要素進(jìn)行相關(guān)的驗證。

7.2設(shè)定合理的精密度評價周期，例如：為期至少20天的檢測，每天至少由2人完成不少于2次的完整檢測，從而對批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間以及不同操作者之間的精密度進(jìn)行綜合評價。

7.3用于精密度評價的人工模擬樣品和臨床樣本均應(yīng)至少包含3個水平：陰性樣品、臨界陽性樣品、（中或強）陽性樣品，并根據(jù)產(chǎn)品特性設(shè)定適當(dāng)?shù)木芏纫?，臨床樣本精密度評價中的每一次檢測均應(yīng)從核酸提取開始。

7.3.1陰性樣本：待測物濃度低于最低檢測限或為零濃度，陰性檢出率應(yīng)≥95%（n≥20）。

7.3.2臨界陽性樣本：待測物濃度略高于試劑盒的最低檢測限，陽性檢出率應(yīng)≥95%（n≥20）。

7.3.3中/強陽性樣本：待測物濃度呈中度到強陽性，陽性檢出率為100%且CV≤10%（n≥20）。

（五）陽性判斷值確定資料

陽性判斷值確定資料主要指對每種聲稱可檢出的病毒核酸檢測的Ct值進(jìn)行確認(rèn)，建議申請人對申報產(chǎn)品用于結(jié)果判斷的臨界值予以確認(rèn)。陽性判斷值研究資料樣本來源應(yīng)考慮不同年齡、性別、地域等因素，盡可能考慮樣本來源的多樣性、代表性。如存在判定值灰區(qū)，應(yīng)提供灰區(qū)的確認(rèn)資料。如采用其他方法對陽性判斷值進(jìn)行確認(rèn)研究，應(yīng)說明這種方法的合理性。提供內(nèi)標(biāo)值的確定方法和研究資料。

（六）穩(wěn)定性研究資料

穩(wěn)定性研究資料主要涉及兩部分內(nèi)容，申報試劑的穩(wěn)定性和適用樣本的穩(wěn)定性研究。前者主要包括實時穩(wěn)定性（有效期）、開瓶穩(wěn)定性及凍融次數(shù)限制等研究，申請人可根據(jù)實際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括研究方法的確定依據(jù)、具體的實施方案、詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。對于實時穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

考慮到病毒RNA極易被降解的特性，企業(yè)也應(yīng)對樣本穩(wěn)定性進(jìn)行研究，主要包括冷藏和冷凍兩種條件下的有效期驗證，可以在合理的溫度范圍內(nèi)，每間隔一定的時間段即對儲存樣本進(jìn)行驗證，從而確認(rèn)不同類型樣本的效期穩(wěn)定性。適于冷凍保存的樣本還應(yīng)對凍融次數(shù)進(jìn)行評價。

對于樣本提取后不能立即進(jìn)行檢測的，應(yīng)明確核酸儲存條件、儲存時間等，同時應(yīng)提供相應(yīng)的核酸穩(wěn)定性研究資料。

試劑穩(wěn)定性和樣本穩(wěn)定性兩部分內(nèi)容的研究結(jié)果均應(yīng)在說明書【儲存條件及有效期】和【樣本要求】兩項中進(jìn)行詳細(xì)說明。

（七）臨床評價資料

臨床試驗的開展、方案的制定以及報告的撰寫等均應(yīng)符合相關(guān)法規(guī)及《體外診斷試劑臨床試驗技術(shù)指導(dǎo)原則》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第16號）的要求。臨床試驗應(yīng)能檢出所有聲稱可檢出的呼吸道病毒，每種呼吸道病毒檢測陽性例數(shù)可采用統(tǒng)計方法進(jìn)行計算，建議每種罕見病毒類型的陽性樣本例數(shù)不少于50例，每種病毒類型的陽性例數(shù)在滿足最低例數(shù)要求的基礎(chǔ)上還應(yīng)符合統(tǒng)計學(xué)要求，方案中需要給出明確的樣本量確定依據(jù)，如每種病毒類型與對照方法的檢測陽性一致率95%的置信區(qū)間下限>90%。臨床試驗應(yīng)選擇不少于3家（含3家）能代表不同地域的臨床試驗機構(gòu)完成。

1.病例選擇及樣本類型

申請人應(yīng)選擇體征/癥狀符合呼吸道感染的目標(biāo)人群，進(jìn)行前瞻性臨床試驗。申請人在建立病例納入標(biāo)準(zhǔn)時，應(yīng)考慮到各年齡段人群的差異，盡量覆蓋各個年齡段人群。在進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計分析時，除總體病例數(shù)的要求外，建議對各年齡段人群分層進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析（如<5、6－21、22－59和>60歲），總體病例數(shù)應(yīng)符合統(tǒng)計學(xué)要求。臨床試驗入組病例應(yīng)與產(chǎn)品預(yù)期用途中適用人群一致。臨床試驗應(yīng)首選新鮮樣本，每種病毒應(yīng)有前瞻性陽性樣本檢出；某些呼吸道病毒在人群中具有低流行率，可用已知含特定病毒的樣本（即留存樣本）進(jìn)行補充。如果選擇留存樣本，則應(yīng)證明凍存或其他保存方法的樣本穩(wěn)定性，且應(yīng)使用盲法，避免檢測偏差。

2.參比方法

申請人應(yīng)選擇已批準(zhǔn)上市、臨床普遍認(rèn)為質(zhì)量較好的同類產(chǎn)品作為參比試劑，采用擬申報產(chǎn)品（以下稱考核試劑）與之進(jìn)行對比試驗研究，證明本品與已上市產(chǎn)品等效或優(yōu)于已上市產(chǎn)品。

如無已上市產(chǎn)品可選用病毒分離培養(yǎng)鑒定或測序方法進(jìn)行比對。對于難以培養(yǎng)的呼吸道病毒（如人偏肺病毒）也可直接采用測序方法作為參比方法。

2.1測序試驗中的核酸擴增方法所測靶序列應(yīng)與申報產(chǎn)品所測靶序列不同，且申請人應(yīng)對該靶序列/引物提供文獻(xiàn)或?qū)嶒炇覕?shù)據(jù)支持。申請人應(yīng)在臨床研究報告中對選用的測序方法做詳細(xì)介紹，并提供以下關(guān)于測序試驗的詳細(xì)信息及資料：

2.1.1測序方法原理、測序儀型號、測序試劑及消耗品的相關(guān)信息。

2.1.2測序方法所用引物相關(guān)信息，如基因區(qū)段選擇、分子量、純度、功能性試驗等資料。

2.1.3對所選測序方法的分析性能進(jìn)行合理驗證，尤其是最低檢測限的確認(rèn)，建議將所選測序方法與擬申報產(chǎn)品的相關(guān)性能進(jìn)行適當(dāng)比對分析。

2.1.4測序方法應(yīng)建立合理的陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品對臨床樣本的檢測結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制。

2.1.5提交有代表性的樣本測序圖譜及結(jié)果分析資料。

2.2病毒培養(yǎng)時，除細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）外，申請人還應(yīng)進(jìn)行病毒鑒定如病毒特異性抗體染色或PCR擴增后測序。單純的CPE無法提供準(zhǔn)確的病毒鑒別。申請人應(yīng)提供病毒分離培養(yǎng)的詳細(xì)實驗室流程，以及特定細(xì)胞系可作為分離某種病毒的文獻(xiàn)或數(shù)據(jù)支持。

3.另外，對于流感病毒，申請人還應(yīng)根據(jù)病毒流行情況選擇新鮮采集樣本，使用考核試劑與流感病毒感染檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”方法—病毒分離培養(yǎng)鑒定方法進(jìn)行比較研究，每種樣本類型不少于30例經(jīng)病毒分離培養(yǎng)方法確定為陽性的樣本。

4.統(tǒng)計學(xué)分析

對臨床試驗結(jié)果的統(tǒng)計應(yīng)選擇合適的統(tǒng)計方法，如檢測結(jié)果一致性分析、陰性/陽性符合率等。對于本類產(chǎn)品對比實驗的等效性研究，常選擇交叉四格表的形式總結(jié)兩種試劑的定性檢測結(jié)果，對定性結(jié)果進(jìn)行四格表卡方或kappa檢驗以驗證兩種試劑定性結(jié)果的一致性，統(tǒng)計分析應(yīng)可以證明兩種方法的檢測結(jié)果無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。在臨床研究方案中應(yīng)明確統(tǒng)計檢驗假設(shè)，即評價考核試劑與參比試劑是否等效的標(biāo)準(zhǔn)。

申請人應(yīng)分別統(tǒng)計各病毒檢測的陰、陽性符合率，同時應(yīng)分別統(tǒng)計混合感染樣本使用考核試劑和參比試劑的檢測結(jié)果。如考核試劑存在灰區(qū)，申請人還應(yīng)統(tǒng)計灰區(qū)樣本使用參比試劑的檢測結(jié)果。

在數(shù)據(jù)收集過程中，對于兩種試劑檢測結(jié)果不一致的樣本，應(yīng)采用“金標(biāo)準(zhǔn)”方法或臨床上普遍認(rèn)為質(zhì)量較好的第三種同類試劑進(jìn)行復(fù)核，同時結(jié)合患者的臨床病情對差異原因及可能結(jié)果進(jìn)行分析。

5.臨床試驗總結(jié)報告撰寫

根據(jù)《體外診斷試劑臨床試驗技術(shù)指導(dǎo)原則》的要求，臨床試驗報告應(yīng)該對試驗的整體設(shè)計及各個關(guān)鍵點給予清晰、完整的闡述，應(yīng)該對整個臨床試驗實施過程、結(jié)果分析、結(jié)論等進(jìn)行條理分明的描述，并應(yīng)包括必要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計分析方法。建議在臨床總結(jié)報告中對以下內(nèi)容進(jìn)行詳述。

5.1臨床試驗總體設(shè)計及方案描述

5.1.1臨床試驗的整體管理情況、臨床研究單位選擇、臨床主要研究人員簡介等基本情況介紹。

5.1.2病例納入/排除標(biāo)準(zhǔn)、不同年齡段人群的預(yù)期選擇例數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)、盲法的操作流程等。

5.1.3樣本類型，樣本的收集、處理及保存等。

5.1.4統(tǒng)計學(xué)方法、統(tǒng)計軟件、評價統(tǒng)計結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)。

5.2具體的臨床試驗情況

5.2.1臨床試驗所用體外診斷試劑及儀器的名稱、批號、機型等信息。

5.2.2對各研究單位的病例數(shù)、年齡分布情況、不同病毒分布情況進(jìn)行綜合，建議以列表或圖示方式列出各年齡組和不同病毒的樣本例數(shù)。

5.2.3質(zhì)量控制，試驗人員培訓(xùn)、儀器日常維護(hù)、儀器校準(zhǔn)、質(zhì)控運行情況。

5.2.4具體試驗過程，樣本收集、樣本保存、樣本檢測、結(jié)果處理、結(jié)果不一致樣本的確認(rèn)等。

5.3統(tǒng)計學(xué)分析

5.3.1數(shù)據(jù)預(yù)處理、差異數(shù)據(jù)的重新檢測或第三方驗證以及是否納入最終數(shù)據(jù)統(tǒng)計、對異常值或缺失值的處理、研究過程中是否涉及對方案的修改。

5.3.2結(jié)果的一致性分析

計算陽性符合率、陰性符合率、總體符合率，采用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計學(xué)方法，如四格表卡方檢驗或kappa檢驗以驗證兩種試劑定性結(jié)果的一致性。

5.4討論和結(jié)論

對總體結(jié)果進(jìn)行總結(jié)性描述并簡要分析試驗結(jié)果，對本次臨床研究有無特別說明，最后得出臨床試驗結(jié)論。

（八）產(chǎn)品技術(shù)要求

申請人應(yīng)當(dāng)在原材料質(zhì)量和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的前提下，根據(jù)申請人產(chǎn)品研制情況、依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及有關(guān)文獻(xiàn)，按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導(dǎo)原則》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第9號）的有關(guān)要求，編寫產(chǎn)品技術(shù)要求。

呼吸道病毒核酸檢測試劑的產(chǎn)品性能指標(biāo)應(yīng)主要包括：物理性狀、陰/陽性參考品符合率、精密度、最低檢測限等。如果申報試劑已有適用的國家標(biāo)準(zhǔn)品、參考品發(fā)布，則申請人應(yīng)在產(chǎn)品技術(shù)要求中提出檢測要求。

按照《辦法》的規(guī)定，此類產(chǎn)品為第三類體外診斷試劑，申請人應(yīng)按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導(dǎo)原則》的要求，以附錄形式明確主要原材料、生產(chǎn)工藝及半成品要求，附錄的編制應(yīng)符合相關(guān)編寫規(guī)范的要求。

（九）產(chǎn)品注冊檢驗報告

應(yīng)提供該產(chǎn)品符合產(chǎn)品技術(shù)要求的、在具有相應(yīng)醫(yī)療器械檢驗資質(zhì)和承檢范圍的醫(yī)療器械檢驗機構(gòu)進(jìn)行的產(chǎn)品檢驗報告；應(yīng)提供連續(xù)3個生產(chǎn)批次樣品的檢驗合格報告。

（十）產(chǎn)品說明書

結(jié)合《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》的要求，下面對呼吸道病毒核酸檢測試劑說明書的重點內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)說明，以指導(dǎo)注冊申報人員更合理地完成說明書編制。

1.【預(yù)期用途】

1.1首段：本產(chǎn)品用于定性檢測人鼻咽拭子、咽拭子或其他樣本的××、××呼吸道病毒核酸。

適用樣本類型應(yīng)結(jié)合實際的臨床研究完成情況進(jìn)行確認(rèn)。應(yīng)明確所有可檢測的病毒種類及亞型。

1.2簡單介紹待測目標(biāo)的特征，如病毒種系淵源、生物學(xué)性狀、宿主特性、致病性、感染后臨床表現(xiàn)、待測靶基因特征等。明確呼吸道病毒核酸試劑的臨床意義，通過對有呼吸道感染體征和癥狀的個體檢測和鑒別特異性病毒核酸，聯(lián)合其他臨床和實驗室結(jié)果以輔助診斷呼吸道病毒感染。

1.3陰性結(jié)果不能排除呼吸道病毒感染，不能用作診斷、治療或其他管理決策的唯一依據(jù)。

1.4陽性結(jié)果不能排除檢測指標(biāo)外細(xì)菌感染或其他病毒混合感染情況。

1.5待測人群特征介紹：具有呼吸道病毒感染癥狀的患者、相關(guān)的密切接觸者、地域要求或年齡限制（如有）等，待測人群應(yīng)與申報產(chǎn)品臨床試驗中入組人群一致。

1.6應(yīng)強調(diào)實驗操作人員應(yīng)接受過基因擴增或分子生物學(xué)方法檢測的專業(yè)培訓(xùn)，具備相關(guān)的實驗操作資格，實驗室應(yīng)具備合理的生物安全防備設(shè)施及防護(hù)程序。

2.【檢驗原理】

詳細(xì)說明試劑盒技術(shù)原理，及核酸分離/純化方法、原理。說明檢測的靶基因座位、序列長度等；介紹引物及探針設(shè)計、不同樣品反應(yīng)體系（管）組合、對照品（質(zhì)控品）設(shè)置及熒光信號標(biāo)記等。如添加了相關(guān)的防污染組分，也應(yīng)對其作用機理作適當(dāng)介紹。

3.【主要組成成分】

3.1說明試劑盒包含組分的名稱、數(shù)量、比例或濃度等信息，陰性/陽性對照品（或質(zhì)控品）可能含有人源組分，應(yīng)提供其生物學(xué)來源、活性及其他特性；明確不同批號試劑盒中各組分是否可以互換。

3.2試劑盒中不包含但對該項檢測必須的組分，企業(yè)應(yīng)列出相關(guān)試劑/耗材的生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品名稱、貨號以及醫(yī)療器械注冊證號/備案號（如有）等詳細(xì)信息。

3.3如果試劑盒中不包含用于核酸分離/純化的試劑組分，則應(yīng)在此注明經(jīng)驗證后推薦配合使用的商品化核酸分離/純化試劑盒的如上信息。

4.【儲存條件及有效期】

試劑盒的效期穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性、復(fù)溶穩(wěn)定性、凍融次數(shù)要求等，應(yīng)與相應(yīng)的穩(wěn)定性研究結(jié)論一致。

5.【適用儀器】

所有適用的儀器型號，提供儀器的生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品名稱、型號以及醫(yī)療器械注冊證號/備案號（如有）等詳細(xì)信息，以指導(dǎo)用戶操作。

6.【樣本要求】重點明確以下內(nèi)容：

6.1樣本采集時間點的選擇：是否受臨床癥狀、用藥情況等因素的影響。

6.2對采樣拭子、容器及保存液的要求：對采樣拭子的材質(zhì)要求（包括對拭子頭和拭子桿的要求）、保存容器、轉(zhuǎn)運保存液的要求、轉(zhuǎn)運條件等。

6.3樣本采集：具體采集部位及類型，詳述具體的操作方法或列出相關(guān)操作指南文件以指導(dǎo)使用者（最好能夠給出具體圖示），盡量減少由于樣本采集或處理不當(dāng)對實驗造成的影響。樣本的取材及處理方式等若有通用的技術(shù)規(guī)范或指南，則應(yīng)遵循，并在此處引用。

6.4樣本處理及保存：核酸提取前的預(yù)處理、保存條件及期限（短期、長期）等。冷藏/冷凍樣本檢測前是否須恢復(fù)室溫，凍融次數(shù)限制。有關(guān)描述均應(yīng)建立在相關(guān)性能評價及穩(wěn)定性研究的基礎(chǔ)上。

7.【檢驗方法】詳細(xì)說明實驗操作的各個步驟，包括：

7.1試劑配制方法、注意事項。

7.2核酸分離/純化的條件、步驟及注意事項。對照品（質(zhì)控品）參與樣本核酸的平行提取要求等。應(yīng)對核酸濃度、純度等指標(biāo)提出質(zhì)量要求。

7.3擴增反應(yīng)前準(zhǔn)備：各組分加樣體積、順序、相關(guān)注意事項等。

7.4逆轉(zhuǎn)錄過程的溫度和時間設(shè)置、PCR各階段的溫度、時間、循環(huán)數(shù)設(shè)置及相關(guān)注意事項。

7.5儀器設(shè)置：特殊參數(shù)，待測基因、內(nèi)標(biāo)的熒光通道選擇等。

7.6質(zhì)量控制：說明對照品（質(zhì)控品）的檢測要求。質(zhì)控品如不與申報產(chǎn)品一同提供，應(yīng)說明質(zhì)控品規(guī)格，包括病毒水平、病毒來源、滅活方法和生物安全性測定方法。

8.【陽性判斷值】

簡要總結(jié)陽性判斷值研究方法及結(jié)論。

9.【檢驗結(jié)果的解釋】

結(jié)合對照品（質(zhì)控品）以及樣本管中靶基因和內(nèi)標(biāo)的檢測結(jié)果，對所有可能出現(xiàn)的結(jié)果組合及相應(yīng)的解釋進(jìn)行詳述。檢驗結(jié)果的解釋應(yīng)以陽性判斷值的研究結(jié)論為依據(jù)。如有適用的臨床診療或篩查指南，則應(yīng)在此項下引用，相應(yīng)檢驗結(jié)果的解釋應(yīng)符合相關(guān)指南的要求。

10.【檢驗方法的局限性】

應(yīng)至少包括如下描述：

10.1本試劑檢測結(jié)果應(yīng)結(jié)合患者臨床癥狀及其他相關(guān)醫(yī)學(xué)檢查結(jié)果進(jìn)行綜合分析，不得單獨作為患者管理的依據(jù)。

10.2檢驗的病毒核酸出現(xiàn)序列變異時會存在假陰性風(fēng)險。

10.3不合理的樣本采集、轉(zhuǎn)運及處理以及不當(dāng)?shù)膶嶒灢僮骱蛯嶒灜h(huán)境均有可能導(dǎo)致假陰性或假陽性結(jié)果。

10.4申報產(chǎn)品應(yīng)明確不同病程不同階段樣本的陽性率不一致。

10.5取標(biāo)本期間，接種減毒活疫苗的患者可能會導(dǎo)致檢測試劑檢測結(jié)果呈陽性。

10.6陽性和陰性預(yù)測值很大程度上取決于流行率。該檢驗性能是在流行季節(jié)期間（如2018/2019）確立。對某些病毒的檢驗性能可能隨檢測流行率和檢測人群變化。

10.7待檢核酸序列可能長時間出現(xiàn)在體內(nèi)，而與病毒活性無關(guān)。核酸檢測陽性并一定不意味著目前感染了相應(yīng)病毒或其為臨床癥狀的致病因子。

11.【產(chǎn)品性能指標(biāo)】

依據(jù)分析性能評估資料，詳述以下性能指標(biāo)：

11.1對相應(yīng)國家標(biāo)準(zhǔn)品、參考品（如有）檢測的符合情況。

11.2最低檢測限

11.3企業(yè)內(nèi)部陽性/陰性參考品符合率

11.4精密度：精密度評價結(jié)果可采用列表形式描述。

11.5分析特異性：建議以列表方式說明驗證的其他呼吸道病毒亞型、相關(guān)病原體等的交叉反應(yīng)性及其驗證濃度水平。總結(jié)潛在干擾物質(zhì)的評價濃度水平及干擾情況。

11.6簡要描述臨床試驗的基本信息、試驗方法和結(jié)論。

12.【注意事項】

應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：

12.1如該產(chǎn)品含有人源或動物源性物質(zhì)，應(yīng)給出生物安全性的警告。

12.2臨床實驗室應(yīng)嚴(yán)格按照《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增實驗室管理辦法》（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號或現(xiàn)行有效版本）等有關(guān)分子生物學(xué)實驗室、臨床基因擴增實驗室的管理規(guī)范執(zhí)行。

12.3強調(diào)產(chǎn)品性能僅針對聲稱的適用樣本類型及【樣本要求】項下說明的樣本采集和處理方法（包括樣本采集液等）進(jìn)行了驗證，其他樣本類型或樣本采集、處理方法不能保證產(chǎn)品性能。

三、名詞解釋

PCR-熒光探針法：在PCR過程中利用熒光標(biāo)記的特異性探針，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，釋放的熒光能量的變化直接反映出PCR擴增產(chǎn)物量的變化，并通過對熒光的采集和分析以達(dá)到對原始模板量進(jìn)行分析的PCR。

四、起草單位

國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心。