地中海貧血相關(guān)基因檢測(cè)試劑注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則（2020年第16號(hào)）

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地中海貧血相關(guān)基因檢測(cè)試劑
注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊(cè)申請(qǐng)人對(duì)地中海貧血相關(guān)基因檢測(cè)試劑注冊(cè)申報(bào)資料的準(zhǔn)備及撰寫，同時(shí)也為技術(shù)審評(píng)部門對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的技術(shù)審評(píng)提供參考。

本指導(dǎo)原則是對(duì)地中海貧血相關(guān)基因檢測(cè)試劑的一般要求，申請(qǐng)人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和細(xì)化。

本指導(dǎo)原則是對(duì)申請(qǐng)人和審查人員的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊(cè)審批所涉及的行政事項(xiàng)，也不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但需要提供詳細(xì)的研究和驗(yàn)證資料，相關(guān)人員應(yīng)在遵循法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時(shí)進(jìn)行調(diào)整。

一、適用范圍

地中海貧血（簡(jiǎn)稱地貧）是一種常染色體隱性遺傳病，是由于珠蛋白基因發(fā)生突變（包括點(diǎn)突變和缺失等），致使珠蛋白肽鏈合成減少或完全不能合成而導(dǎo)致的一組單基因遺傳性溶血性疾病，輕者可無(wú)臨床表現(xiàn)，重者以進(jìn)行性溶血性貧血為主要特征。根據(jù)珠蛋白肽鏈合成受到抑制的類型，地貧分為α-，β-和γ-地貧等，臨床上最常見的是α-和β-地貧。地貧主要分布在地中海沿岸、東南亞和少數(shù)非洲地區(qū)，具有明顯的種族特性和地域分布差異。地貧是我國(guó)南方地區(qū)最常見、危害最大的遺傳病之一，尤以廣西、云南、廣東、海南、四川和貴州等省份為甚，云南、海南和廣東的地貧基因人群攜帶率可達(dá)10%以上，廣西更是達(dá)到了20%以上。

α-地貧主要是由于α-珠蛋白基因發(fā)生突變而引起。α-珠蛋白基因簇位于16p13.3，包括胎兒期和成人期表達(dá)的2個(gè)基因（α2和α1），基因的排列順序?yàn)?’-α2-α1-3’。根據(jù)單倍型的情況，可將α地貧分為3類：（1）缺失型α+地貧（-α/），缺失1個(gè)α基因；（2）缺失型α0地貧（--/），2個(gè)α基因同時(shí)缺失；（3）非缺失型α+地貧（αTα/或ααT/ ），1個(gè)α1或α2基因發(fā)生點(diǎn)突變或少數(shù)幾個(gè)堿基的缺失。中國(guó)現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)至少19種α-珠蛋白基因大片段缺失和38種α-珠蛋白基因點(diǎn)突變。其中，6 種α-珠蛋白基因的突變：--SEA/、-α3.7/、-α4.2/、αWSα/（HBA2：c.369C>G）、αQSα/（HBA2：c.377 T>C）；αCSα/（HBA2：c.427T>C）占患病人群總數(shù)的98%。

α-地貧基因型和臨床分型的關(guān)系已經(jīng)基本闡明。α-地貧的表型嚴(yán)重程度隨著功能性α-珠蛋白基因的減少而加重：（1）1個(gè)α-基因缺失或點(diǎn)突變（-α/αα或ααT/αα或αTα/αα），稱為靜止型α-地貧，通常不貧血，血液學(xué)表現(xiàn)為小細(xì)胞低色素；（2）2個(gè)α-基因缺失或復(fù)合-α基因點(diǎn)突變，或點(diǎn)突變，其基因型為--/αα或-α/-α或-α/ααT或αTα/-α或αTα/αTα，稱為輕型α-地貧，臨床表現(xiàn)為不貧血或輕度貧血，血液學(xué)檢查有小細(xì)胞低色素特征；（3）3個(gè)α-基因缺失或復(fù)合α基因點(diǎn)突變，基因型為--/-α或--/αTα，稱為中間型α-地貧，又稱Hb H病，患者有輕至重度貧血。某些基因型為αTα/αTα的病例（如αCSα/αCSα、αQSα/αQSα和αCSα/αQSα）也表現(xiàn)為Hb H病。通常，--/αTα的非缺失型 Hb H病較單純?nèi)笔虷b H?。?-/-α）的臨床表現(xiàn)更為嚴(yán)重，特別是基因型為--/αCSα或--/αQSα的Hb H病患者，貧血程度較為嚴(yán)重；（4）4個(gè)α-基因缺失，其基因型為--/--，稱為重型α-地貧，又稱Hb Bart’s胎兒水腫綜合征，此類個(gè)體一般無(wú)法存活到出生或分娩后半小時(shí)內(nèi)死亡。

β-地貧是由于β-珠蛋白基因發(fā)生突變而引起，以點(diǎn)突變?yōu)橹?，少?shù)為缺失型。β-珠蛋白基因簇位于11p15.3，包括2個(gè)成人期表達(dá)基因（β和δ），基因的排列順序?yàn)?’-δ-β-3’。根據(jù)β-珠蛋白鏈合成量的程度，可將β-地貧分為3類：（1）β0地貧，β-珠蛋白鏈完全不能合成，其所在的等位基因稱為β0地貧等位基因；（2）β+地貧，β-珠蛋白鏈合成減少，其所在的等位基因稱為β+地貧等位基因；（3）β++地貧，又稱沉默型β-地貧，β-珠蛋白鏈合成輕微減少。中國(guó)已至少報(bào)道84種β-珠蛋白基因點(diǎn)突變和11種β-珠蛋白基因缺失。其中，6種點(diǎn)突變：HBB：c.126_129delCTTT，HBB：c.52A>T，HBB：c.-78A>G，HBB： c.79G>A，HBB： c.316-197C>T和HBB： c.216_217insA占了全部突變類型的90%以上。

β-地貧的臨床表型可分為4種：（1）靜止型β-地貧，基因型為β++/βN，血液學(xué)表型正?；蚺R界，一般只能通過(guò)分子診斷識(shí)別；（2）輕型β-地貧，基因型為β0/βN或β+/βN，臨床表現(xiàn)為小細(xì)胞低色素和HbA2值升高；（3）中間型β-地貧，基因型為β+/β+或β+/β0，表型變異范圍大，可從輕度貧血到中度貧血，多于幼兒期出現(xiàn)中度貧血；（4）重型β-地貧，基因型為β+/β0或β0/β0，通常伴有嚴(yán)重貧血，需要定期輸血才能存活?；純撼錾鷷r(shí)無(wú)癥狀，常于嬰兒期（3-12月齡）發(fā)病。如不治療，患兒多于5歲前死亡。此外，中間型的分子基礎(chǔ)較為復(fù)雜，顯性β-地貧突變的雜合子（βD/βN），合并α-地貧突變的β-地貧突變純合子（β0/β0），或合并α-珠蛋白三聯(lián)體的β-地貧突變雜合子（β0/βN或β+/βN），也會(huì)顯示中間型的表型。

2018年發(fā)布的《重型β-地中海貧血的診斷和治療指南》明確規(guī)定：對(duì)于重型β-地中海貧血的診斷，有條件者均應(yīng)進(jìn)行基因診斷，基因型為純合子或雙重雜合子為確診本病的指標(biāo)。2018年發(fā)布的《兒童非輸血依賴型地中海貧血的診治和管理專家共識(shí)》也明確規(guī)定：地貧基因檢測(cè)為非輸血依賴型地貧的診斷依據(jù)之一。

另外，國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布的相關(guān)文件要求：為減少重型地貧患兒出生，在我國(guó)地貧高發(fā)省份實(shí)施地貧防控試點(diǎn)項(xiàng)目。主要流程包括：（1）對(duì)新婚夫婦和計(jì)劃懷孕夫婦在懷孕前或孕期進(jìn)行血常規(guī)初篩；（2）對(duì)夫婦一方或雙方血常規(guī)檢查結(jié)果陽(yáng)性的夫婦進(jìn)行血紅蛋白分析復(fù)篩；（3）對(duì)血紅蛋白分析復(fù)篩結(jié)果均為陽(yáng)性的夫婦，取其抗凝靜脈全血進(jìn)行相應(yīng)的α+β地貧基因檢測(cè)；（4）綜合夫婦雙方病史詢問(wèn)、地貧篩查和基因檢測(cè)結(jié)果，判定為高風(fēng)險(xiǎn)夫婦。對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)夫婦進(jìn)行追蹤，及時(shí)了解受檢婦女懷孕情況，指導(dǎo)女方在懷孕后適宜時(shí)期接受產(chǎn)前診斷。產(chǎn)前診斷的對(duì)象為胎兒，樣本類型為胎兒的絨毛、羊水和臍帶血，檢測(cè)項(xiàng)目為相應(yīng)的地貧基因檢測(cè)。

綜上，結(jié)合該類產(chǎn)品臨床使用的實(shí)際情況，本指導(dǎo)原則的預(yù)期用途可為：用于體外定性檢測(cè)人外周靜脈全血或胎兒羊水等樣本中基因組DNA的α-和/或β-地貧相關(guān)基因，用于α-和/或β-地貧的輔助診斷（遺傳診斷），地貧高風(fēng)險(xiǎn)夫婦的評(píng)估，或胎兒的產(chǎn)前遺傳診斷等。

結(jié)合該類產(chǎn)品在中國(guó)注冊(cè)的實(shí)際情況以及當(dāng)前的認(rèn)知，本指導(dǎo)原則僅對(duì)“α-和/或β-地貧的輔助診斷（遺傳診斷）”預(yù)期用途的相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行了詳細(xì)闡述。針對(duì)其他預(yù)期用途，本指導(dǎo)原則僅對(duì)部分內(nèi)容進(jìn)行了闡述，申請(qǐng)人應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品特性，對(duì)本指導(dǎo)原則未涉及的內(nèi)容進(jìn)行補(bǔ)充并做出相應(yīng)評(píng)價(jià)。

本指導(dǎo)原則的技術(shù)要求是基于PCR探針?lè)ǚ椒ń⒌?，?duì)于其他分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)（如：PCR-反向點(diǎn)雜交法和gap-PCR法等），可能部分要求不完全適用或本文所述技術(shù)指標(biāo)不夠全面，申請(qǐng)人可以根據(jù)產(chǎn)品特性對(duì)不適用部分進(jìn)行或補(bǔ)充其他的評(píng)價(jià)和驗(yàn)證，但需闡述不適用的理由，并驗(yàn)證替代方法的科學(xué)合理性。

本指導(dǎo)原則適用于進(jìn)行首次注冊(cè)申報(bào)和相關(guān)許可事項(xiàng)變更的產(chǎn)品。

二、注冊(cè)申報(bào)資料要求

（一）綜述資料

綜述資料主要包括產(chǎn)品預(yù)期用途、產(chǎn)品描述、有關(guān)生物安全性的說(shuō)明、研究結(jié)果的總結(jié)評(píng)價(jià)以及國(guó)內(nèi)外同類產(chǎn)品上市情況介紹等內(nèi)容。其中，同類產(chǎn)品上市情況介紹部分應(yīng)著重從方法學(xué)、檢驗(yàn)原理、檢測(cè)的突變類型以及臨床意義等方面詳細(xì)說(shuō)明申報(bào)產(chǎn)品與目前市場(chǎng)上已獲批準(zhǔn)的同類產(chǎn)品之間的主要區(qū)別。

綜述資料應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊(cè)管理辦法》（原總局令第5號(hào)，以下簡(jiǎn)稱《辦法》）和《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》（原總局公告2014年第44號(hào)），以下簡(jiǎn)稱《44號(hào)公告》的要求。

（二）主要原材料的研究資料

主要原材料研究資料包括主要反應(yīng)成分、對(duì)照品（質(zhì)控品）及企業(yè)參考品的研究資料。

1. 此類產(chǎn)品的主要反應(yīng)成分一般包括人基因組核酸提取/純化試劑、檢測(cè)所需引物、探針、酶、dNTPs、反應(yīng)緩沖液等。申請(qǐng)人應(yīng)提交相關(guān)原材料的選擇、制備和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等的研究資料。如為申請(qǐng)人自制，應(yīng)提交詳細(xì)的工藝穩(wěn)定性研究資料；如為外購(gòu)，還應(yīng)提交供應(yīng)商篩選資料以及供應(yīng)商提供的原材料質(zhì)量檢定報(bào)告。

1.1 核酸提取/純化試劑（如有）的主要組成、原理介紹及相關(guān)的驗(yàn)證資料。

1.2 引物、探針

申請(qǐng)人應(yīng)詳述引物、探針的設(shè)計(jì)原則，提供引物、探針核酸序列、模板核酸序列及兩者的對(duì)應(yīng)情況。建議設(shè)計(jì)多套引物探針以供篩選，針對(duì)待測(cè)位點(diǎn)的特異性等進(jìn)行評(píng)價(jià)，選擇最佳設(shè)計(jì)，并提交詳細(xì)的篩選研究數(shù)據(jù)。

申請(qǐng)人應(yīng)針對(duì)選定的引物、探針原材料進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，一般包括：分子量、純度（HPLC等）、濃度、探針熒光標(biāo)記基團(tuán)的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)，以及功能性試驗(yàn)等，并依據(jù)評(píng)價(jià)結(jié)果建立合理的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1.3酶

酶包括DNA聚合酶和尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG/UNG）等。申請(qǐng)人應(yīng)針對(duì)各種酶的活性進(jìn)行驗(yàn)證，提交功能性試驗(yàn)資料，并確定酶的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

DNA聚合酶應(yīng)具有DNA聚合酶活性，無(wú)核酸內(nèi)切酶活性，具熱穩(wěn)定性。UDG/UNG應(yīng)具有水解尿嘧啶糖苷鍵的活性，無(wú)核酸外切酶及核酸內(nèi)切酶活性。

1.4脫氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）

包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP或dUTP；應(yīng)提交對(duì)其純度、濃度、保存穩(wěn)定性等的驗(yàn)證資料，以及功能性試驗(yàn)資料，并確定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

2. 對(duì)照品（質(zhì)控品）

試劑盒的質(zhì)控體系通過(guò)設(shè)置各種試劑盒對(duì)照品（質(zhì)控品）來(lái)實(shí)現(xiàn)。陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)至少包括代表性的突變位點(diǎn)和突變類型。陰性對(duì)照可以是含有野生型序列的核酸溶液?？瞻讓?duì)照為不含核酸的溶液。

如該類產(chǎn)品所采用的方法學(xué)和檢驗(yàn)原理顯示：無(wú)論檢測(cè)何種樣本（野生型、雜合突變和純合突變），其反應(yīng)體系均可報(bào)出核酸序列結(jié)果，均可對(duì)管內(nèi)抑制導(dǎo)致的假陰性結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制，則無(wú)需另外設(shè)置內(nèi)標(biāo)；否則，試劑盒應(yīng)另外設(shè)置內(nèi)標(biāo)。

對(duì)照品可采用人基因組DNA、細(xì)胞系或質(zhì)粒等?？瞻讓?duì)照應(yīng)參與樣本核酸的平行提取。申請(qǐng)人應(yīng)提供對(duì)照品原料選擇、制備、定值過(guò)程等的詳細(xì)研究數(shù)據(jù)，并對(duì)其檢測(cè)結(jié)果做出明確的范圍要求。

3. 企業(yè)參考品

企業(yè)參考品主要包括陽(yáng)性參考品、陰性參考品、檢測(cè)限參考品和精密度參考品等。申請(qǐng)人應(yīng)提交企業(yè)參考品的原料選擇、制備方法、基因序列確認(rèn)及檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的詳細(xì)研究資料等。

3.1 陽(yáng)性參考品：可采用臨床樣本或其核酸溶液，如采用臨床樣本，則樣本類型應(yīng)與待測(cè)樣本一致。應(yīng)至少包含所有檢測(cè)位點(diǎn)的雜合型樣本，同時(shí)盡量納入純合突變型樣本。對(duì)于某些稀有基因型，也可采用細(xì)胞系或質(zhì)粒。

3.2 陰性參考品：應(yīng)包括野生型臨床樣本或其核酸溶液，以及易產(chǎn)生交叉反應(yīng)的同源序列樣本，同時(shí)應(yīng)盡量包含檢測(cè)范圍外其他檢測(cè)位點(diǎn)的樣本等。

3.3檢測(cè)限參考品可選擇最低檢測(cè)限濃度（例如：95%檢出率水平）或接近最低檢測(cè)限濃度（例如100%檢出率水平）的臨床樣本或其核酸溶液，至少包含所有檢測(cè)位點(diǎn)的雜合型樣本。

3.4 精密度參考品應(yīng)至少包括低濃度雜合突變型臨床樣本或其核酸溶液，應(yīng)至少包括代表性的突變位點(diǎn)和突變類型，且在每一反應(yīng)體系均有分布。

目前，該類產(chǎn)品已有國(guó)家參考品，對(duì)于申報(bào)產(chǎn)品所聲稱的檢測(cè)位點(diǎn)，企業(yè)參考品的要求應(yīng)不低于國(guó)家參考品。

（三）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料

主要生產(chǎn)工藝研究資料包括工作液配制（引物、探針濃度、酶濃度、dNTPs濃度、緩沖液離子濃度等）、分裝和凍干（如有）、熒光標(biāo)記（如有）等工藝過(guò)程的描述及確定依據(jù)。生產(chǎn)過(guò)程應(yīng)對(duì)關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行有效控制，可采用流程圖方式描述生產(chǎn)工藝，標(biāo)明關(guān)鍵工藝質(zhì)控步驟，并詳細(xì)說(shuō)明該步驟的質(zhì)控方法及質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

反應(yīng)體系研究指反應(yīng)條件的選擇確定過(guò)程，包括樣本采集、預(yù)處理（如有）、樣本用量、試劑用量、核酸提取純化步驟、PCR反應(yīng)條件、閾值循環(huán)數(shù)（Ct值）等的確定。

不同適用機(jī)型的反應(yīng)條件如有差異應(yīng)分別提交。

（四）分析性能評(píng)估資料

申請(qǐng)人應(yīng)針對(duì)下述各項(xiàng)分析性能提交詳細(xì)的評(píng)估資料，包括試驗(yàn)地點(diǎn)、適用儀器、試劑規(guī)格、批號(hào)、試驗(yàn)方法、試驗(yàn)樣本（類型、來(lái)源、數(shù)量、處理方法、基因型和濃度確認(rèn)等）、可接受標(biāo)準(zhǔn)、統(tǒng)計(jì)方法、試驗(yàn)數(shù)據(jù)及結(jié)論等。分析性能評(píng)估的實(shí)驗(yàn)方法可以參考國(guó)內(nèi)外有關(guān)體外診斷產(chǎn)品性能評(píng)估的指導(dǎo)原則。

每項(xiàng)性能評(píng)估應(yīng)盡量采用與適用樣本類型一致的臨床樣本，對(duì)于某些稀有基因型，也可采用細(xì)胞系等。

1. 核酸提取/純化性能（如有）

在進(jìn)行靶核酸檢測(cè)前，應(yīng)有適當(dāng)?shù)暮怂崽崛?純化步驟。該步驟應(yīng)最大量分離和純化目的核酸并盡可能去除PCR抑制物。無(wú)論檢測(cè)試劑是否含有核酸提取/純化組分，申請(qǐng)人都應(yīng)對(duì)配套使用的核酸提取/純化方法的提取效率和提取核酸純度、濃度等做充分的驗(yàn)證，并評(píng)價(jià)該方法能否滿足該類產(chǎn)品的要求。

2. 檢測(cè)準(zhǔn)確性

建議采用若干份臨床樣本驗(yàn)證該類產(chǎn)品的檢測(cè)準(zhǔn)確性，樣本類型與說(shuō)明書聲稱的樣本類型一致。樣本應(yīng)涵蓋野生型、所有檢測(cè)位點(diǎn)的雜合突變型，同時(shí)盡量納入純合突變型。對(duì)于某些稀有基因型，也可采用細(xì)胞系或質(zhì)粒。

3. 最低檢測(cè)限

該類產(chǎn)品的最低檢測(cè)限可定義為：在滿足一定的檢測(cè)準(zhǔn)確性和精密度的條件下，能夠檢出目標(biāo)序列的最低人基因組DNA的濃度?？刹捎锰荻葷舛鹊娜嘶蚪MDNA樣本進(jìn)行多次重復(fù)檢測(cè)，確定適當(dāng)檢出率水平（如：95%）下的最低人基因組DNA濃度。檢測(cè)限評(píng)價(jià)建議采用臨床樣本或細(xì)胞系，并至少包含所有檢測(cè)位點(diǎn)的雜合突變型。應(yīng)明確臨床樣本或細(xì)胞系與人基因組DNA濃度的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

4. 分析特異性

4.1 應(yīng)針對(duì)同源序列或檢測(cè)范圍外基因和位點(diǎn)進(jìn)行交叉反應(yīng)驗(yàn)證，說(shuō)明交叉反應(yīng)樣本的制備方法、核酸序列確認(rèn)方法，提交詳細(xì)的驗(yàn)證資料。

4.2 應(yīng)針對(duì)可能的內(nèi)源和外源性干擾物進(jìn)行干擾試驗(yàn)研究。內(nèi)源干擾物主要涉及血脂、膽紅素、血紅蛋白和白蛋白、母體細(xì)胞的干擾等，外源干擾物主要包括血液樣本采集可能用到的抗凝劑和常用藥物等。

干擾試驗(yàn)可通過(guò)在臨床樣本中人工添加干擾物質(zhì)的方式，評(píng)價(jià)干擾物質(zhì)對(duì)目標(biāo)序列檢測(cè)的影響，也可直接采集暴露于干擾因素后的受試者樣本，進(jìn)行干擾試驗(yàn)評(píng)價(jià)。建議申請(qǐng)人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度（“最差條件”）條件下進(jìn)行評(píng)價(jià)；如有干擾，應(yīng)確定不產(chǎn)生干擾的最高濃度。

5. 精密度

精密度評(píng)價(jià)應(yīng)采用臨床樣本進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)操作完全按照說(shuō)明書執(zhí)行，包含核酸提取/純化等步驟（如有）。應(yīng)對(duì)每一反應(yīng)體系進(jìn)行精密度評(píng)價(jià)，并至少覆蓋代表性的突變位點(diǎn)和突變類型。

精密度評(píng)價(jià)需滿足如下要求：

5.1對(duì)可能影響檢測(cè)精密度的主要因素進(jìn)行驗(yàn)證，除檢測(cè)試劑本身外，還包括分析儀器、操作者、地點(diǎn)、時(shí)間、檢測(cè)輪次和試劑批次等。

5.2設(shè)定合理的精密度評(píng)價(jià)周期，對(duì)批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間以及不同操作者之間的精密度進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。如有條件，申請(qǐng)人應(yīng)選擇不同的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)以對(duì)室間重復(fù)性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

5.3用于精密度評(píng)價(jià)的臨床樣本至少設(shè)置低濃度和中/高濃度水平。

5.4精密度指標(biāo)可設(shè)置為CV等（如有），申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)精密度指標(biāo)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求。

（五）陽(yáng)性判斷值確定資料

建議納入一定數(shù)量的臨床樣本，應(yīng)包括所有檢測(cè)位點(diǎn)的各種基因型（野生型、雜合突變型，同時(shí)盡量納入純合突變型），采用受試者工作特征（ROC）曲線或其他合理方法確定陽(yáng)性判斷值。

如試劑判讀存在灰區(qū)，應(yīng)解釋說(shuō)明灰區(qū)范圍的確定方法。

對(duì)于某些檢測(cè)方法學(xué)，陽(yáng)性判斷值研究可能不適用，申請(qǐng)人應(yīng)說(shuō)明理由。

（六）穩(wěn)定性研究資料

穩(wěn)定性研究資料主要包括申報(bào)產(chǎn)品的穩(wěn)定性研究和適用樣本的穩(wěn)定性研究?jī)刹糠?。前者主要包括申?bào)產(chǎn)品的實(shí)時(shí)穩(wěn)定性、開瓶/復(fù)溶穩(wěn)定性、運(yùn)輸穩(wěn)定性及凍融次數(shù)限制的研究等；后者則是指適用樣本的保存條件和保存時(shí)間等的研究。

實(shí)時(shí)穩(wěn)定性研究應(yīng)采用至少三批樣品在實(shí)際儲(chǔ)存條件下保存至成品有效期后，選取多個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行產(chǎn)品性能評(píng)價(jià)，從而確定產(chǎn)品保存條件和有效期。

如核酸提取液可保存，還需對(duì)核酸提取液的保存條件和保存時(shí)間進(jìn)行研究。

（七）臨床試驗(yàn)

應(yīng)滿足《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》（原國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第16號(hào)）的要求，如相關(guān)法規(guī)、文件有更新，臨床試驗(yàn)應(yīng)符合更新后的要求。下面僅說(shuō)明該類產(chǎn)品臨床試驗(yàn)中應(yīng)關(guān)注的重點(diǎn)問(wèn)題。

1．針對(duì)“α-和/或β-地貧的輔助診斷（遺傳診斷）”預(yù)期用途

1.1 臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)及人員

申請(qǐng)人應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品特點(diǎn)及預(yù)期用途，綜合不同地區(qū)人種和流行病學(xué)背景等因素，選擇不少于3家（含3家）符合法規(guī)要求的臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)開展臨床試驗(yàn)。

1.2 臨床試驗(yàn)適用人群和臨床樣本

具有地貧癥狀和/或體征，或血液學(xué)表現(xiàn)為小細(xì)胞低色素的疑似地貧患者和攜帶者；需與地貧進(jìn)行鑒別診斷的其他疾病患者，如：缺鐵性貧血、鐵粒細(xì)胞性貧血或先天性紅細(xì)胞生成異常性貧血等。

臨床試驗(yàn)所用樣本應(yīng)為抗凝外周血樣本（基因組DNA非臨床樣本）。臨床樣本的采集、處理、保存和提取等應(yīng)分別滿足申報(bào)產(chǎn)品說(shuō)明書、對(duì)比試劑說(shuō)明書（如適用）及第三方試劑說(shuō)明書（如適用）的相關(guān)要求。

1.3臨床試驗(yàn)方法

1.3.1已有同類產(chǎn)品上市的申報(bào)產(chǎn)品

對(duì)于已批準(zhǔn)的α-地貧突變和β-地貧突變，原則上選擇已上市同類產(chǎn)品作為對(duì)比試劑，評(píng)價(jià)申報(bào)產(chǎn)品的臨床檢測(cè)性能。

1.3.2無(wú)同類產(chǎn)品上市的申報(bào)產(chǎn)品

1.3.2.1 如新突變位點(diǎn)的臨床意義已獲行業(yè)認(rèn)可（如：國(guó)內(nèi)相關(guān)指南或?qū)＜夜沧R(shí)），且上述認(rèn)可基于充分的中國(guó)人群的臨床數(shù)據(jù)，則臨床試驗(yàn)可選擇Sanger基因測(cè)序（針對(duì)新的點(diǎn)突變）或臨床普遍使用的其他公認(rèn)方法（針對(duì)其他類型的新突變位點(diǎn)，如缺失）作為對(duì)比方法，評(píng)價(jià)新突變位點(diǎn)的臨床檢測(cè)性能。除此之外，還應(yīng)提交新位點(diǎn)臨床意義已獲行業(yè)認(rèn)可的相關(guān)證據(jù)，該部分資料可不納入臨床方案和報(bào)告。

1.3.2.2 如新突變位點(diǎn)的臨床意義未獲行業(yè)認(rèn)可，則臨床試驗(yàn)應(yīng)包括兩個(gè)目的，新突變位點(diǎn)的臨床檢測(cè)性能評(píng)價(jià)和臨床意義評(píng)價(jià)。新突變位點(diǎn)的臨床檢測(cè)性能評(píng)價(jià)可參考1.3.2.1；新突變位點(diǎn)的臨床意義評(píng)價(jià)應(yīng)提交基于中國(guó)人群的充分的臨床證據(jù)，證明基因型與表型的關(guān)系，如：隨訪或其他可證明基因型與表型關(guān)系的臨床驗(yàn)證資料。

1.4最低樣本量和陽(yáng)性例數(shù)

臨床試驗(yàn)樣本量應(yīng)采用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行估算，并詳細(xì)描述所使用統(tǒng)計(jì)方法及各參數(shù)的確定依據(jù)。

1.4.1 臨床檢測(cè)性能評(píng)價(jià)的樣本量估算

臨床檢測(cè)性能評(píng)價(jià)的樣本量估算可分為以下幾種情況。

對(duì)于常見突變位點(diǎn)，建議采用單組目標(biāo)值法分別估算每個(gè)突變位點(diǎn)臨床試驗(yàn)的最低樣本量，通過(guò)陽(yáng)性符合率計(jì)算所需陽(yáng)性樣本的例數(shù)，通過(guò)陰性符合率計(jì)算所需陰性樣本的例數(shù)，同時(shí)考慮脫落情況，估算最低樣本總量。陽(yáng)性符合率和陰性符合率的目標(biāo)值（臨床可接受的最低標(biāo)準(zhǔn)）建議均不低于95%。

對(duì)于罕見突變位點(diǎn)，陰性樣本的例數(shù)可根據(jù)上述方法進(jìn)行估算，陽(yáng)性樣本則應(yīng)保證一定的例數(shù)。

對(duì)于極其罕見的、且有確切臨床證據(jù)證明其臨床意義的突變位點(diǎn)，陰性樣本的例數(shù)可根據(jù)上述方法進(jìn)行估算，陽(yáng)性樣本的例數(shù)則應(yīng)結(jié)合臨床證據(jù)確定。

1.4.2 新位點(diǎn)臨床意義評(píng)價(jià)的樣本量估算

新位點(diǎn)臨床意義評(píng)價(jià)的樣本量估算，建議采用抽樣調(diào)查公式或其他合理方法進(jìn)行估算。

2. 針對(duì)“地貧高風(fēng)險(xiǎn)夫婦的評(píng)估”和“胎兒的產(chǎn)前遺傳診斷”預(yù)期用途

針對(duì)上述兩個(gè)預(yù)期用途，本指導(dǎo)原則僅對(duì)部分內(nèi)容進(jìn)行了闡述，申請(qǐng)人應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品特性，充分考慮本指導(dǎo)原則未涉及的內(nèi)容，設(shè)計(jì)科學(xué)合理的臨床試驗(yàn)并進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2.1臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)和人員

如申報(bào)產(chǎn)品的預(yù)期用途為胎兒的產(chǎn)前遺傳診斷，除滿足法規(guī)要求外，臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)還應(yīng)取得產(chǎn)前診斷技術(shù)服務(wù)資質(zhì)。臨床試驗(yàn)人員應(yīng)為經(jīng)過(guò)專門培訓(xùn)的取得資質(zhì)的人員。機(jī)構(gòu)和人員應(yīng)遵循《產(chǎn)前診斷技術(shù)管理辦法》《母嬰保健專項(xiàng)技術(shù)服務(wù)許可及人員資格管理辦法》，機(jī)構(gòu)應(yīng)取得《母嬰保健技術(shù)服務(wù)執(zhí)業(yè)許可證》，人員應(yīng)取得《母嬰保健技術(shù)考核合格證書》。

2.2 臨床試驗(yàn)適用人群和臨床樣本

如預(yù)期用途為地貧高風(fēng)險(xiǎn)夫婦的評(píng)估，則適用人群為：地貧表型篩查陽(yáng)性的育齡人群。地貧表型篩查陽(yáng)性的育齡人群可根據(jù)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)和地貧高發(fā)地區(qū)相關(guān)政策確定。

如預(yù)期用途為胎兒的產(chǎn)前遺傳診斷，則適用人群為：地貧高風(fēng)險(xiǎn)夫婦的胎兒。地貧高風(fēng)險(xiǎn)夫婦的確定可參考國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)等相關(guān)文件。

臨床試驗(yàn)所用樣本應(yīng)為胎兒羊水等臨床樣本（基因組DNA非臨床樣本）。臨床樣本的采集、處理、保存和提取等應(yīng)符合國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)等相關(guān)文件的要求，并滿足產(chǎn)品說(shuō)明書的要求。

2.3 最低樣本量和陽(yáng)性例數(shù)

針對(duì)每種不同的預(yù)期用途，應(yīng)分別采用合理方法估算最低樣本量。同一預(yù)期用途的不同樣本類型（羊水和臍帶血等），也應(yīng)分別采用合理方法估算最低樣本量。

3. 如有其他預(yù)期用途，也應(yīng)設(shè)計(jì)科學(xué)的臨床試驗(yàn)，提供充分的證據(jù)，證明其預(yù)期用途。

4. 不同預(yù)期用途的通用要求

4.1 臨床試驗(yàn)方法、數(shù)據(jù)及統(tǒng)計(jì)分析

4.1.1應(yīng)在臨床試驗(yàn)方案或報(bào)告中明確申報(bào)產(chǎn)品、對(duì)比試劑和第三方試劑的試驗(yàn)方法。

4.1.2臨床試驗(yàn)病例總結(jié)表應(yīng)以列表方式表示，包括申報(bào)產(chǎn)品的結(jié)果、對(duì)比試劑的結(jié)果、第三方試劑的檢測(cè)結(jié)果（如有）、臨床診斷、年齡和性別等。

4.1.3以交叉表分別總結(jié)兩種試劑的定性檢測(cè)結(jié)果，選擇合適的統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以驗(yàn)證兩種試劑檢測(cè)結(jié)果的一致性。

4.1.4 結(jié)果差異樣本的驗(yàn)證

在數(shù)據(jù)收集過(guò)程中，對(duì)于兩種試劑檢測(cè)結(jié)果不一致的樣本，采用合理方法進(jìn)行復(fù)核，并對(duì)差異原因進(jìn)行分析。如無(wú)需復(fù)核，應(yīng)說(shuō)明理由。

4.2 臨床試驗(yàn)方案

各臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的方案設(shè)置應(yīng)基本一致，且保證在整個(gè)臨床試驗(yàn)過(guò)程中遵循預(yù)定的方案，不可隨意改動(dòng)。整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程應(yīng)在臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)并由該實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)人員操作完成，申報(bào)單位的技術(shù)人員除進(jìn)行必要的技術(shù)指導(dǎo)外，不得隨意干涉實(shí)驗(yàn)進(jìn)程。

試驗(yàn)方案應(yīng)確定嚴(yán)格的入選/排除標(biāo)準(zhǔn)，任何已入選的樣本被排除出臨床試驗(yàn)都應(yīng)記錄在案并明確說(shuō)明原因。在試驗(yàn)操作過(guò)程和結(jié)果判定時(shí)，應(yīng)采用盲法以保證試驗(yàn)結(jié)果的客觀性。各臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)選用的對(duì)比試劑/方法應(yīng)保持一致，以便進(jìn)行合理的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。另外，申報(bào)產(chǎn)品的樣本類型不應(yīng)超越對(duì)比試劑/方法對(duì)樣本類型的要求。

4.3臨床試驗(yàn)報(bào)告

應(yīng)對(duì)試驗(yàn)的整體設(shè)計(jì)及各個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)給予清晰、完整的闡述，應(yīng)該對(duì)整個(gè)臨床試驗(yàn)實(shí)施過(guò)程、結(jié)果分析、結(jié)論等進(jìn)行條理分明的描述，并應(yīng)包括必要的數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)分析方法。

（八）產(chǎn)品技術(shù)要求

產(chǎn)品技術(shù)要求應(yīng)符合《辦法》、《44號(hào)公告》和《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導(dǎo)原則》（原國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第9號(hào)）的相關(guān)要求。該類產(chǎn)品作為三類體外診斷試劑，應(yīng)將主要原材料、生產(chǎn)工藝及半成品要求等內(nèi)容作為附錄附于技術(shù)要求正文后。

目前，該類產(chǎn)品已有行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，產(chǎn)品技術(shù)要求的相關(guān)要求應(yīng)不低于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的要求。

（九）產(chǎn)品檢驗(yàn)報(bào)告

根據(jù)《辦法》的要求，第三類體外診斷試劑申請(qǐng)注冊(cè)時(shí)應(yīng)提交連續(xù)三個(gè)生產(chǎn)批次樣品的檢驗(yàn)報(bào)告。目前，該產(chǎn)品已有國(guó)家參考品，產(chǎn)品檢驗(yàn)應(yīng)滿足國(guó)家參考品的要求。

（十）產(chǎn)品說(shuō)明書

產(chǎn)品說(shuō)明書應(yīng)滿足《體外診斷試劑說(shuō)明書編寫指導(dǎo)原則》（原國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第17號(hào)）的要求，產(chǎn)品說(shuō)明書的所有內(nèi)容均應(yīng)與申請(qǐng)人提交的注冊(cè)申報(bào)資料的相關(guān)研究結(jié)果保持一致。下面對(duì)該類產(chǎn)品說(shuō)明書的重點(diǎn)內(nèi)容進(jìn)行闡述。

1.【預(yù)期用途】應(yīng)至少包括以下幾部分內(nèi)容：

1.1本產(chǎn)品用于定性檢測(cè)人xx樣本基因組DNA中的α-和/或β-地貧xx突變，用于：α-和/或β-地貧的輔助診斷（遺傳診斷），地貧高風(fēng)險(xiǎn)夫婦的評(píng)估，或胎兒的產(chǎn)前遺傳診斷。

1.2介紹地貧相關(guān)的臨床背景信息及實(shí)驗(yàn)室診斷方法等，介紹被測(cè)靶標(biāo)（突變位點(diǎn)）的相關(guān)情況。

2.【主要組成成分】

2.1說(shuō)明試劑盒包含組分的名稱或數(shù)量等信息，說(shuō)明不同批號(hào)試劑盒中各組分是否可以互換。

2.2試劑盒中不包含但對(duì)該項(xiàng)檢測(cè)必須的組分，企業(yè)應(yīng)列出相關(guān)試劑/耗材的名稱及其他相關(guān)信息。

2.3如果試劑盒中不包含用于核酸提取純化的試劑組分，則應(yīng)在此注明經(jīng)過(guò)驗(yàn)證后配合使用的商品化核酸提取純化試劑盒的生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品名稱以和醫(yī)療器械備案號(hào)（如有）等詳細(xì)信息。

3.【檢驗(yàn)原理】

3.1對(duì)試劑盒的被測(cè)靶標(biāo)進(jìn)行詳細(xì)描述（基因位置、突變位點(diǎn)及相關(guān)特征等），對(duì)試劑盒所用探針、引物或突變的判定等進(jìn)行詳細(xì)介紹；對(duì)不同樣本反應(yīng)管組合、對(duì)照品設(shè)置及熒光信號(hào)檢測(cè)原理等進(jìn)行介紹。

3.2試劑盒技術(shù)原理的詳細(xì)介紹，建議結(jié)合適當(dāng)圖示進(jìn)行說(shuō)明。如反應(yīng)體系中添加了相關(guān)的防污染組分（如UNG酶），也應(yīng)對(duì)其作用機(jī)理進(jìn)行適當(dāng)介紹。

4.【儲(chǔ)存條件及有效期】

說(shuō)明試劑盒的效期穩(wěn)定性等，應(yīng)明確具體的儲(chǔ)存條件及有效期等信息。

5.【樣本要求】

樣本的采集、處理、運(yùn)送和保存：明確樣本采集、核酸提取純化前的處理（如離心和洗滌等）、保存條件及期限以及運(yùn)送條件等。冷藏/冷凍樣本檢測(cè)前是否需要恢復(fù)至室溫，凍融次數(shù)的限制等。

6.【適用儀器】

所有適用的儀器型號(hào)，并提供與儀器有關(guān)的重要信息以指導(dǎo)用戶操作。

7.【檢驗(yàn)方法】

詳細(xì)說(shuō)明實(shí)驗(yàn)操作的各個(gè)步驟，包括：

7.1實(shí)驗(yàn)條件：實(shí)驗(yàn)室分區(qū)、實(shí)驗(yàn)環(huán)境的溫度、濕度和空調(diào)氣流方向控制等注意事項(xiàng)。

7.2試劑配制方法和注意事項(xiàng)。

7.3詳述核酸提取純化的條件、步驟及注意事項(xiàng)（如適用），對(duì)核酸提取純化環(huán)節(jié)進(jìn)行合理質(zhì)控，明確提取核酸的濃度純度等質(zhì)量要求。

7.4擴(kuò)增反應(yīng)前準(zhǔn)備：加樣體積、順序等。

7.5 PCR各階段的溫度、時(shí)間設(shè)置、循環(huán)數(shù)設(shè)置或相應(yīng)的自動(dòng)化檢測(cè)程序及相關(guān)注意事項(xiàng)。

7.6儀器設(shè)置（如適用）：特殊參數(shù)、探針的熒光素標(biāo)記情況、對(duì)待測(cè)樣本及其他對(duì)照品的熒光通道選擇等。

8.【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

結(jié)合對(duì)照品、樣本管檢測(cè)結(jié)果以及檢測(cè)類型，以列表形式詳述所有可能出現(xiàn)的結(jié)果及相應(yīng)的解釋。如存在檢測(cè)灰區(qū)，應(yīng)詳述對(duì)于灰區(qū)結(jié)果的處理方式。

9.【檢驗(yàn)方法的局限性】

9.1申報(bào)產(chǎn)品僅對(duì)下述檢測(cè)類型xx進(jìn)行了驗(yàn)證。

9.2有關(guān)假陰性結(jié)果的可能性分析

9.2.1不合理的樣本采集、運(yùn)送及處理或核酸過(guò)度降解均有可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果。

9.2.2未經(jīng)驗(yàn)證的其他干擾或PCR抑制因子等可能會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果（如有）。

10.【產(chǎn)品性能指標(biāo)】簡(jiǎn)述以下性能指標(biāo)：

10.1最低檢測(cè)限：簡(jiǎn)單介紹最低檢測(cè)限的確定方法，并明確最低檢測(cè)限結(jié)果。

10.2陽(yáng)性/陰性參考品符合率。

10.3精密度：簡(jiǎn)單介紹精密度的確定方法，并明確精密度結(jié)果。

10.4分析特異性

10.4.1交叉反應(yīng)驗(yàn)證：同源性序列等交叉反應(yīng)驗(yàn)證。

10.4.2干擾物質(zhì)驗(yàn)證：樣本中常見干擾物質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。

10.5對(duì)比試驗(yàn)研究（如有）：簡(jiǎn)要介紹對(duì)比試劑（方法）的信息、所采用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法及統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。

11.【注意事項(xiàng)】應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：

11.1如該產(chǎn)品含有人源或動(dòng)物源性物質(zhì)，應(yīng)給出具有潛在感染性的警告。

11.2臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)嚴(yán)格按照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室管理辦法》現(xiàn)行有效版本等有關(guān)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室、臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的管理規(guī)范執(zhí)行。

三、起草單位

國(guó)家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心。