結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(cè)試劑注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則（2018年第57號(hào)）

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結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(cè)試劑
注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊(cè)申請(qǐng)人對(duì)結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(cè)試劑注冊(cè)申報(bào)資料的準(zhǔn)備及撰寫，同時(shí)也為技術(shù)審評(píng)部門對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的技術(shù)審評(píng)提供參考。

本指導(dǎo)原則是對(duì)結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(cè)試劑的一般要求，申請(qǐng)人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，如不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和細(xì)化。

本指導(dǎo)原則是對(duì)申請(qǐng)人和審查人員的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊(cè)審批所涉及的行政事項(xiàng)，也不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但需要提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料，相關(guān)人員應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時(shí)進(jìn)行調(diào)整。

一、范圍

結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)（即γ-干擾素釋放試驗(yàn)，IGRAs）的主要原理：受到結(jié)核分枝桿菌抗原刺激致敏的T淋巴細(xì)胞（T細(xì)胞）再次遇到相同抗原時(shí)可產(chǎn)生γ-干擾素，IGRAs通過(guò)檢測(cè)全血或者分離自全血的外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）在結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激下產(chǎn)生的γ-干擾素，判斷受試者是否存在結(jié)核分枝桿菌感染。目前，國(guó)際上較成熟的IGRAs有兩種：一是采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）方法檢測(cè)全血中致敏T細(xì)胞再次受到結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激后釋放的γ-干擾素水平；二是采用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ELISPOT）方法測(cè)定在結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激下，外周血單個(gè)核細(xì)胞中能夠釋放γ-干擾素的效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量。

上述兩種檢測(cè)方法的原理類似，檢測(cè)技術(shù)和操作程序略有不同，采用的結(jié)核分枝桿菌特異性抗原主要存在于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中，在卡介苗和大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌中缺失。

目前，結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(cè)試劑是指：利用免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，如ELISA或ELISPOT技術(shù)等，以結(jié)核分枝桿菌特異抗原刺激T細(xì)胞產(chǎn)生的γ-干擾素為檢測(cè)靶標(biāo)，對(duì)人靜脈全血中的結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)進(jìn)行體外檢測(cè)的試劑，可用于結(jié)核分枝桿菌感染的檢測(cè)或用于結(jié)核病的輔助診斷。本指導(dǎo)原則所述內(nèi)容是針對(duì)結(jié)核病輔助診斷預(yù)期用途的，對(duì)于預(yù)期用途為結(jié)核分枝桿菌感染檢測(cè)的申報(bào)試劑，申請(qǐng)人可以根據(jù)產(chǎn)品特性對(duì)不適用部分進(jìn)行修訂或補(bǔ)充其他的評(píng)價(jià)和驗(yàn)證。

本指導(dǎo)原則的技術(shù)要求是基于ELISA和ELISPOT方法建立的，對(duì)于其他方法，可能部分要求不完全適用或本文所述技術(shù)指標(biāo)不夠全面，申請(qǐng)人可以根據(jù)產(chǎn)品特性對(duì)不適用部分進(jìn)行修訂或補(bǔ)充其他的評(píng)價(jià)和驗(yàn)證，但需闡述不適用的理由，并驗(yàn)證替代方法的科學(xué)合理性。本指導(dǎo)原則適用于進(jìn)行首次注冊(cè)申報(bào)和相關(guān)許可事項(xiàng)變更的產(chǎn)品。

二、注冊(cè)申報(bào)資料要求

（一）綜述資料

綜述資料主要包括產(chǎn)品預(yù)期用途、產(chǎn)品描述、有關(guān)生物安全性的說(shuō)明、研究結(jié)果的總結(jié)評(píng)價(jià)以及國(guó)內(nèi)外同類產(chǎn)品上市情況介紹等內(nèi)容。其中，同類產(chǎn)品上市情況介紹部分應(yīng)著重從預(yù)期用途、方法學(xué)、檢驗(yàn)原理、結(jié)核分枝桿菌特異性刺激抗原以及最低檢測(cè)限等方面寫明申報(bào)試劑與目前市場(chǎng)上已獲批準(zhǔn)的同類產(chǎn)品之間的主要區(qū)別。如所用刺激抗原為新發(fā)現(xiàn)的結(jié)核分枝桿菌特異性抗原，則應(yīng)詳細(xì)論述其能提高該類試劑靈敏度和特異性的科學(xué)依據(jù)，并提供充分的支持資料。

綜述資料應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊(cè)管理辦法》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局令第5號(hào)，以下簡(jiǎn)稱《辦法》）和《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局公告2014年第44號(hào)，以下簡(jiǎn)稱44號(hào)公告）的相關(guān)要求。

（二）主要原材料的研究資料

應(yīng)提供主要原材料如抗原肽/重組抗原、抗體、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、標(biāo)準(zhǔn)品（γ-干擾素）、酶以及企業(yè)參考品等的選擇與來(lái)源、制備過(guò)程、質(zhì)量分析和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)等的研究資料。如主要原材料為企業(yè)自己生產(chǎn)，其生產(chǎn)工藝必須相對(duì)穩(wěn)定；如主要原材料購(gòu)自其他供應(yīng)商，應(yīng)提供的資料包括：供應(yīng)商提供的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、出廠檢定報(bào)告或性能指標(biāo)證書(shū)，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗(yàn)資料。

企業(yè)參考品：申請(qǐng)人應(yīng)提供企業(yè)參考品的詳細(xì)的來(lái)源、制備和確定等資料。

對(duì)于采用ELISPOT方法的申報(bào)試劑，企業(yè)參考品至少應(yīng)包括：陰性參考品、陽(yáng)性參考品和精密度參考品。其中，陽(yáng)性參考品建議采用結(jié)核病患者（菌陰和菌陽(yáng)）的全血，陰性參考品建議采用健康人和其他易混淆疾病患者的全血，精密度參考品建議采用結(jié)核病患者的全血。如申請(qǐng)人采用除全血之外的其他樣本形式作為企業(yè)參考品，請(qǐng)?zhí)峤簧暾?qǐng)人所采用的企業(yè)參考品的組成、來(lái)源、穩(wěn)定性、延續(xù)性、性能可控性等詳細(xì)的理論和試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

對(duì)于采用ELISA方法的申報(bào)試劑，企業(yè)參考品至少應(yīng)包括：陰性參考品、陽(yáng)性參考品、最低檢測(cè)限參考品、線性參考品、準(zhǔn)確度參考品和精密度參考品等。其中，陰性參考品、陽(yáng)性參考品和精密度參考品的設(shè)置可參考ELISPOT方法申報(bào)試劑的相關(guān)要求。最低檢測(cè)限參考品、準(zhǔn)確度參考品和線性參考品，主要考察ELISA部分的性能，可采用含有γ-干擾素的溶液（建議采用血漿作為基質(zhì)溶液）。

對(duì)于陰性/陽(yáng)性對(duì)照：申報(bào)試劑的質(zhì)控體系通過(guò)設(shè)置陽(yáng)性、陰性對(duì)照來(lái)實(shí)現(xiàn)，申報(bào)資料應(yīng)詳細(xì)描述各種對(duì)照的原料選擇、制備、定值過(guò)程等試驗(yàn)資料。本指導(dǎo)原則的技術(shù)要求是基于ELISA和ELISPOT方法建立的，對(duì)于采用上述方法學(xué)的結(jié)核細(xì)胞類檢測(cè)試劑，建議至少設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照一般采用外周血單個(gè)核細(xì)胞非特異性刺激物，用于質(zhì)控外周血單個(gè)核細(xì)胞功能是否正常，避免產(chǎn)生假陰性。陰性對(duì)照用于控制細(xì)胞在活化過(guò)程中所產(chǎn)生的各種因子的非特異性影響，避免產(chǎn)生假陽(yáng)性。

標(biāo)準(zhǔn)品（如適用）的選擇及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：應(yīng)詳細(xì)描述標(biāo)準(zhǔn)品原料的來(lái)源、制備、純度、濃度（或復(fù)溶后濃度）、分子量、功能活性等的確定和驗(yàn)證資料。

多肽/重組抗原的選擇及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：應(yīng)詳細(xì)描述多肽的來(lái)源（來(lái)自何種抗原）/重組抗原的來(lái)源、組成、分子量、純度、濃度、重組抗原的內(nèi)毒素含量、刺激活性、特異性等的確定和驗(yàn)證資料。如為凍干抗原，還應(yīng)設(shè)置水分含量的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

抗體的選擇及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：應(yīng)詳細(xì)描述抗體的來(lái)源、純度、濃度、分子量、刺激免疫原、效價(jià)和功能活性等的確定和驗(yàn)證資料。

（三）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料

主要生產(chǎn)工藝包括：配制工作液、分裝和包裝等，可用流程圖表示。應(yīng)提供主要生產(chǎn)工藝的確定依據(jù)，包括試驗(yàn)方法和數(shù)據(jù)等。

反應(yīng)體系研究資料應(yīng)能對(duì)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)中檢驗(yàn)方法部分涉及的基本內(nèi)容，如樣本用量、試劑用量、反應(yīng)條件等，提供確定的依據(jù)，包括試驗(yàn)方法和數(shù)據(jù)等。

（四）分析性能評(píng)估資料

申請(qǐng)人應(yīng)提交對(duì)申報(bào)試劑進(jìn)行的所有性能驗(yàn)證的研究資料，包括具體的試驗(yàn)方法、內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)分析等。對(duì)于結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(cè)試劑，建議著重對(duì)以下分析性能進(jìn)行研究。

1.對(duì)于采用ELISA方法的申報(bào)試劑

檢驗(yàn)方法分為兩大部分：（1）將結(jié)核分枝桿菌特異性抗原與全血樣本共培養(yǎng)，獲得含有γ-干擾素的血漿樣本；（2）以γ-干擾素標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)第（1）步的血漿樣本采用ELISA方法進(jìn)行定量檢測(cè)。基于該方法學(xué)的分析性能，需要對(duì)上述兩方面的性能均進(jìn)行驗(yàn)證。

1.1最低檢測(cè)限

申請(qǐng)人可采用合理方法確定和驗(yàn)證申報(bào)試劑的最低檢測(cè)限。建議采用含有系列γ-干擾素稀釋濃度的樣本，對(duì)每個(gè)濃度樣本進(jìn)行多次重復(fù)檢測(cè)，選取測(cè)定平均OD值-2SD大于0濃度測(cè)定平均OD值+2SD的濃度作為最低檢測(cè)限濃度。

1.2線性范圍

線性范圍確定的研究應(yīng)使用高值樣本（采用血漿基質(zhì)，采用可溯源至國(guó)際校準(zhǔn)品的方法對(duì)血漿樣本中的γ-干擾素進(jìn)行定量）進(jìn)行梯度稀釋，稀釋液應(yīng)使用血漿，應(yīng)包含接近最低檢測(cè)限的臨界值濃度。通過(guò)評(píng)價(jià)一定范圍內(nèi)的線性關(guān)系確定申報(bào)試劑的線性范圍。

1.3準(zhǔn)確度

可采用如下方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，如：與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品的偏差分析、回收試驗(yàn)或者方法學(xué)比對(duì)等方法，申請(qǐng)人可根據(jù)實(shí)際情況選擇合理方法進(jìn)行研究。

1.4分析特異性

1.4.1交叉反應(yīng)

交叉反應(yīng)的驗(yàn)證主要考慮全血自身含有的細(xì)胞因子或全血刺激培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的細(xì)胞因子與申報(bào)試劑所用γ-干擾素抗體對(duì)是否存在交叉反應(yīng)。需要進(jìn)行交叉反應(yīng)驗(yàn)證的細(xì)胞因子包括：IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、TNFα、IFN-α和IFN-β等。建議在0濃度γ-干擾素水平和中濃度γ-干擾素水平分別進(jìn)行交叉反應(yīng)的驗(yàn)證。

同時(shí)，建議申請(qǐng)人采用一定數(shù)量的其他常見(jiàn)分枝桿菌感染患者的全血樣本進(jìn)行試驗(yàn)，評(píng)價(jià)申報(bào)試劑的特異性。

1.4.2干擾物質(zhì)

應(yīng)對(duì)全血樣本中常見(jiàn)的干擾物質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證，包括：抗凝劑、甘油三酯、血紅蛋白、膽紅素、類風(fēng)濕因子、抗核抗體、抗線粒體抗體和免疫抑制劑等。建議采用含有不同濃度γ-干擾素的血漿樣本分別進(jìn)行干擾物質(zhì)的驗(yàn)證，給出不會(huì)對(duì)γ-干擾素檢測(cè)值產(chǎn)生干擾的最高干擾物濃度。

1.5精密度

1.5.1采用全血樣本進(jìn)行試驗(yàn)的精密度：分別采用陽(yáng)性全血樣本和陰性全血樣本，進(jìn)行不少于10次重復(fù)檢測(cè)，判斷檢測(cè)結(jié)果的陰陽(yáng)性，多次重復(fù)檢測(cè)結(jié)果應(yīng)一致。

1.5.2采用含有γ-干擾素的血漿樣本進(jìn)行試驗(yàn)的精密度：建議在γ-干擾素低濃度和中等濃度2個(gè)濃度水平分別進(jìn)行驗(yàn)證。

1.5.2.1低濃度樣本：γ-干擾素濃度略高于試劑盒的最低檢測(cè)限（n≥20）。

1.5.2.2中等濃度樣本：采用中等濃度的樣本進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，CV≤15%（n≥20）。

1.5.3申請(qǐng)人應(yīng)設(shè)置合理的精密度評(píng)價(jià)周期，以便對(duì)批內(nèi)/批間以及不同操作者之間的精密度進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

1.6陰性參考品符合率

建議選擇至少15份健康人和其他易混淆疾病患者的全血樣本進(jìn)行試驗(yàn)，上述健康人和患者應(yīng)包括不同等級(jí)的結(jié)核菌素（PPD）皮試人群。

1.7陽(yáng)性參考品符合率

建議選擇至少20份結(jié)核病患者（至少10例菌陽(yáng)，至少10例菌陰）全血樣本進(jìn)行試驗(yàn)。

1.8標(biāo)準(zhǔn)品的溯源資料

γ-干擾素具有國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品，建議檢測(cè)結(jié)果的量值溯源至國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品。申請(qǐng)人應(yīng)提供從國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品到產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)品的溯源鏈以及各級(jí)賦值資料。

2.對(duì)于采用ELISPOT方法的申報(bào)試劑

檢驗(yàn)方法為：將結(jié)核分枝桿菌特異性抗原與分離的外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）共培養(yǎng)，活化刺激PBMC分泌的γ-干擾素被微孔板上包被的單克隆抗體捕獲，再用酶標(biāo)記的另一個(gè)單克隆抗體進(jìn)行反應(yīng)顯色，一個(gè)斑點(diǎn)即代表一個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)斑點(diǎn)的多少，從而判斷是否存在結(jié)核分枝桿菌特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)?；谠摲椒▽W(xué)的分析性能，需從下述幾個(gè)方面進(jìn)行性能驗(yàn)證。

2.1分析特異性

2.1.1交叉反應(yīng)

交叉反應(yīng)的驗(yàn)證主要考慮PBMC刺激培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的細(xì)胞因子與申報(bào)試劑所用γ-干擾素抗體對(duì)是否存在交叉反應(yīng)。需要進(jìn)行交叉反應(yīng)驗(yàn)證的細(xì)胞因子包括：IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、TNFα、IFN-α和IFN-β等。建議在0濃度γ-干擾素水平和中濃度γ-干擾素水平分別進(jìn)行交叉反應(yīng)的驗(yàn)證。

同時(shí)，建議申請(qǐng)人采用一定數(shù)量的其他常見(jiàn)分枝桿菌感染患者的全血樣本進(jìn)行試驗(yàn)，評(píng)價(jià)申報(bào)試劑的特異性。

2.1.2干擾物質(zhì)

應(yīng)對(duì)全血樣本中常見(jiàn)的干擾物質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證，包括：抗凝劑、甘油三酯、血紅蛋白、膽紅素、類風(fēng)濕因子、抗核抗體、抗線粒體抗體和免疫抑制劑等。建議采用全血樣本進(jìn)行干擾物質(zhì)的驗(yàn)證，給出不產(chǎn)生干擾的最高干擾物濃度。

2.2精密度

采用全血樣本（包括高斑點(diǎn)數(shù)樣本、中等斑點(diǎn)數(shù)和低斑點(diǎn)數(shù)樣本）分別進(jìn)行精密度評(píng)價(jià)，進(jìn)行不少于10次重復(fù)試驗(yàn)，判斷檢測(cè)結(jié)果的陰陽(yáng)性，多次重復(fù)檢測(cè)結(jié)果應(yīng)一致。同時(shí)，還應(yīng)計(jì)數(shù)檢測(cè)孔斑點(diǎn)數(shù)，計(jì)算其CV值，CV值應(yīng)≤25%。

申請(qǐng)人應(yīng)設(shè)置合理的精密度評(píng)價(jià)周期，以便對(duì)批內(nèi)/批間以及不同操作者之間的精密度進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

2.3陰性參考品符合率

建議選擇至少15份健康人和其他易混淆疾病患者的全血樣本進(jìn)行試驗(yàn)，上述健康人和患者應(yīng)包括不同等級(jí)的結(jié)核菌素（PPD）皮試人群。

2.4陽(yáng)性參考品符合率

建議選擇至少20份結(jié)核病患者（至少10例菌陽(yáng)，至少10例菌陰）全血樣本進(jìn)行試驗(yàn)。

（五）陽(yáng)性判斷值的研究資料

此類試劑的陽(yáng)性判斷值較為復(fù)雜，陽(yáng)性判斷值對(duì)應(yīng)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)中“檢驗(yàn)結(jié)果的解釋”部分的內(nèi)容，申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)中“檢驗(yàn)結(jié)果的解釋”部分所涉及的各個(gè)數(shù)值提供詳細(xì)的確定和驗(yàn)證資料。該部分資料應(yīng)采用臨床樣本進(jìn)行試驗(yàn)，請(qǐng)注意臨床樣本的選擇應(yīng)與申報(bào)產(chǎn)品聲稱的預(yù)期用途相一致。建議采用受試者工作特征（ROC）曲線的方式進(jìn)行確定。

（六）穩(wěn)定性研究資料

穩(wěn)定性包括申報(bào)試劑穩(wěn)定性和樣本穩(wěn)定性（包括全血樣本穩(wěn)定性和血漿樣本穩(wěn)定性）。前者主要包括實(shí)時(shí)穩(wěn)定性（有效期）、開(kāi)封穩(wěn)定性及凍融次數(shù)限制（如適用）等。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括研究方法的確定依據(jù)、具體的實(shí)施方案、詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)及結(jié)論。對(duì)于實(shí)時(shí)穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少三批樣品在實(shí)際儲(chǔ)存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

試劑穩(wěn)定性和樣本穩(wěn)定性兩部分內(nèi)容的研究結(jié)果均應(yīng)在說(shuō)明書(shū)【儲(chǔ)存條件及有效期】和【樣本要求】?jī)身?xiàng)中進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。

（七）臨床試驗(yàn)

臨床試驗(yàn)總體要求及臨床試驗(yàn)資料的內(nèi)容應(yīng)符合《辦法》、44號(hào)公告和《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第16號(hào)）的規(guī)定，以下僅結(jié)合結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(cè)試劑的具體特點(diǎn)對(duì)其臨床試驗(yàn)中應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注的內(nèi)容進(jìn)行闡述。

1.臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的選擇

申請(qǐng)人應(yīng)當(dāng)選定不少于3家（含3家）臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)，按照法規(guī)要求開(kāi)展臨床試驗(yàn)。

2.對(duì)比試劑的選擇

對(duì)于預(yù)期用于結(jié)核病輔助診斷的申報(bào)試劑，申請(qǐng)人可選擇境內(nèi)已批準(zhǔn)上市、臨床普遍認(rèn)為質(zhì)量較好的同類產(chǎn)品作為對(duì)比試劑，采用試驗(yàn)用體外診斷試劑（以下稱申報(bào)試劑）與對(duì)比試劑進(jìn)行比較研究試驗(yàn)，證明本品與已上市產(chǎn)品等效。

3.臨床試驗(yàn)對(duì)象的選擇

對(duì)于預(yù)期用于結(jié)核病輔助診斷的申報(bào)產(chǎn)品，臨床試驗(yàn)對(duì)象應(yīng)滿足：（1）臨床試驗(yàn)總病例至少1000例；（2）具有結(jié)核病相關(guān)體征/癥狀的疑似結(jié)核病患者；（3）最終臨床診斷為結(jié)核病患者的病例中，應(yīng)包括肺結(jié)核患者和肺外結(jié)核患者，并且涂片陰性的肺結(jié)核患者占所有肺結(jié)核患者的比例不應(yīng)小于50%；單純肺外結(jié)核患者至少30例；（4）非結(jié)核的其他呼吸道疾病患者以及其他易混淆疾病的患者病例（最終臨床診斷不是結(jié)核病），包括肺炎、肺癌、支氣管炎、支氣管擴(kuò)張、非結(jié)核分枝桿菌病、慢阻肺等，其中肺癌至少50例；（5）上述人群應(yīng)包括PPD陰性和陽(yáng)性人群，不能人為選擇PPD陰性人群進(jìn)行臨床試驗(yàn)；（6）各臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的樣本量和樣本分布應(yīng)相對(duì)均衡。

全血樣本不能凍融，臨床試驗(yàn)應(yīng)采用新鮮樣本，樣本采集和保存等應(yīng)滿足申報(bào)試劑和對(duì)比試劑說(shuō)明書(shū)的相關(guān)要求。

4.臨床試驗(yàn)方法、臨床原始數(shù)據(jù)及統(tǒng)計(jì)分析

4.1分別依據(jù)申報(bào)試劑和對(duì)比試劑各自的說(shuō)明書(shū)對(duì)入組臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，記錄結(jié)果。

4.2臨床報(bào)告中應(yīng)明確：總樣本例數(shù)；臨床診斷為肺結(jié)核患者的總例數(shù)，說(shuō)明涂片陰性和涂片陽(yáng)性的肺結(jié)核患者例數(shù)；肺外結(jié)核患者的例數(shù)，說(shuō)明各類肺外結(jié)核患者的例數(shù)；非結(jié)核的其他呼吸道疾病患者以及易混淆疾病樣本例數(shù)，并詳細(xì)說(shuō)明各類非結(jié)核疾病的患者例數(shù)。

4.3臨床原始數(shù)據(jù)應(yīng)以列表的方式表示，包括每個(gè)病例樣本的年齡、性別、臨床診斷結(jié)果、申報(bào)試劑的結(jié)果以及對(duì)比試劑的結(jié)果等。

4.4對(duì)臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)應(yīng)選擇合適的統(tǒng)計(jì)方法，如受試者工作特征（ROC）曲線分析、陰性/陽(yáng)性符合率等。常選擇四格表的形式總結(jié)兩種試劑的定性檢測(cè)結(jié)果，對(duì)定性結(jié)果進(jìn)行四格表卡方或kappa檢驗(yàn)以驗(yàn)證兩種試劑定性結(jié)果的一致性，統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)可以證明兩種方法的檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

4.5申報(bào)試劑對(duì)涂片陰性的肺結(jié)核患者和肺外結(jié)核患者均應(yīng)有一定的檢出率。

5.結(jié)果差異樣本的驗(yàn)證

對(duì)于兩種試劑檢測(cè)結(jié)果不一致的樣本，應(yīng)采用臨床上公認(rèn)較好的第三方試劑或其他合理方法進(jìn)行復(fù)核，同時(shí)結(jié)合患者的臨床病情對(duì)差異原因及可能結(jié)果進(jìn)行分析。

6.臨床試驗(yàn)方案

各臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的方案設(shè)置應(yīng)保持一致，且保證在整個(gè)臨床試驗(yàn)過(guò)程中遵循預(yù)定的方案實(shí)施，不可隨意改動(dòng)。整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程應(yīng)在臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)并由本實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)人員操作完成，申請(qǐng)人的技術(shù)人員除進(jìn)行必要的技術(shù)指導(dǎo)外，不得隨意干涉試驗(yàn)進(jìn)程，尤其是數(shù)據(jù)收集過(guò)程。

試驗(yàn)方案中應(yīng)確定嚴(yán)格的樣本入選/排除標(biāo)準(zhǔn)，任何已經(jīng)入選的樣本再被排除出臨床試驗(yàn)都應(yīng)記錄在案并明確說(shuō)明原因。各臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)選用的對(duì)比試劑應(yīng)保持一致，以便進(jìn)行合理的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

7.其他問(wèn)題

如果申報(bào)試劑的預(yù)期用途為結(jié)核分枝桿菌感染的檢測(cè)，申請(qǐng)人應(yīng)按照法規(guī)要求，設(shè)置合理的對(duì)比方法，選擇合適的預(yù)期適用人群，進(jìn)行臨床試驗(yàn)。

（八）產(chǎn)品技術(shù)要求

產(chǎn)品技術(shù)要求應(yīng)符合《辦法》和《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導(dǎo)原則》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第9號(hào)）的相關(guān)規(guī)定。內(nèi)容主要包含產(chǎn)品性能指標(biāo)和檢驗(yàn)方法，并在附錄中明確主要原材料、生產(chǎn)工藝及半成品檢定要求。

對(duì)于采用ELISA方法的申報(bào)試劑，產(chǎn)品技術(shù)要求的性能指標(biāo)至少應(yīng)包括：外觀、陰性參考品符合率、陽(yáng)性參考品符合率、線性、準(zhǔn)確度、最低檢測(cè)限和精密度等。對(duì)于采用ELISPOT方法的申報(bào)試劑，產(chǎn)品技術(shù)要求的性能指標(biāo)至少應(yīng)包括：外觀、陰性參考品符合率、陽(yáng)性參考品符合率和精密度。

（九）產(chǎn)品注冊(cè)檢驗(yàn)報(bào)告

根據(jù)《辦法》要求，首次申請(qǐng)注冊(cè)的第三類產(chǎn)品應(yīng)在具有相應(yīng)醫(yī)療器械檢驗(yàn)資質(zhì)和承檢范圍的醫(yī)療器械檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)進(jìn)行連續(xù)三個(gè)生產(chǎn)批次樣品的注冊(cè)檢測(cè)。

（十）產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的格式應(yīng)符合《體外診斷試劑說(shuō)明書(shū)編寫指導(dǎo)原則》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第17號(hào)）的要求，境外試劑的中文說(shuō)明書(shū)除格式要求外，其內(nèi)容應(yīng)盡量保持與原文說(shuō)明書(shū)一致，翻譯力求準(zhǔn)確且符合中文表達(dá)習(xí)慣。產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的所有內(nèi)容均應(yīng)與申請(qǐng)人提交的注冊(cè)申報(bào)資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致。結(jié)合《體外診斷試劑說(shuō)明書(shū)編寫指導(dǎo)原則》的要求，下面對(duì)結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(cè)試劑說(shuō)明書(shū)的重點(diǎn)內(nèi)容進(jìn)行說(shuō)明。

1.【預(yù)期用途】

應(yīng)至少包括以下幾部分內(nèi)容：

1.1本產(chǎn)品用于體外定性檢測(cè)人新鮮外周靜脈抗凝血中結(jié)核分枝桿菌特異性的T細(xì)胞免疫反應(yīng)，用于結(jié)核分枝桿菌感染的檢測(cè)或者用于結(jié)核病的輔助診斷（根據(jù)臨床試驗(yàn)等研究資料確認(rèn)預(yù)期用途）。

1.2說(shuō)明與預(yù)期用途相關(guān)的臨床適應(yīng)癥背景情況，說(shuō)明相關(guān)的臨床或?qū)嶒?yàn)室診斷方法。

1.3待測(cè)人群特征介紹：具有結(jié)核病相關(guān)體征/癥狀的疑似結(jié)核病患者、地域要求或年齡限制（如有）等。

2.【主要組成成分】

2.1說(shuō)明試劑盒包含組分的名稱、數(shù)量、比例或濃度等信息，說(shuō)明不同批號(hào)試劑盒中各組分是否可以互換。

2.2試劑盒中不包含但對(duì)該項(xiàng)檢測(cè)必須的組分，應(yīng)列出相關(guān)試劑/耗材的名稱、貨號(hào)及其他相關(guān)信息。

2.3申報(bào)試劑的注冊(cè)單元不應(yīng)包含真空采血管，真空采血管應(yīng)按相應(yīng)法規(guī)申報(bào)注冊(cè)。

3.【檢驗(yàn)原理】

3.1說(shuō)明試劑盒所用的刺激抗原/抗原肽（名稱、是否多肽抗原/重組抗原），以及所用抗原/抗原肽在卡介苗和非結(jié)核分枝桿菌中的存在情況。

3.2試劑盒技術(shù)原理的詳細(xì)介紹，建議結(jié)合適當(dāng)圖示進(jìn)行說(shuō)明。

4.【儲(chǔ)存條件及有效期】

說(shuō)明試劑盒的效期穩(wěn)定性、開(kāi)封穩(wěn)定性、復(fù)融穩(wěn)定性、凍融次數(shù)要求（如適用）等，應(yīng)明確具體的儲(chǔ)存條件及有效期。

5.【樣本要求】

重點(diǎn)明確以下內(nèi)容：

5.1樣本的采集：明確所用抗凝劑。

5.2樣本的保存：

5.2.1對(duì)于采用ELISPOT方法的申報(bào)試劑，應(yīng)明確：全血樣本進(jìn)行外周血單個(gè)核細(xì)胞分離前的保存溫度與時(shí)間；分離后外周血單個(gè)核細(xì)胞在與抗原孵育培養(yǎng)前的保存溫度與時(shí)間。

5.2.2對(duì)于采用ELISA方法的申報(bào)試劑，應(yīng)明確：全血樣本在與抗原孵育培養(yǎng)前的保存溫度與時(shí)間。

6.【檢驗(yàn)方法】

該類產(chǎn)品的檢測(cè)步驟繁多，應(yīng)詳細(xì)描述從全血采集開(kāi)始到結(jié)果判讀前的每個(gè)步驟，并明確注意事項(xiàng)。重點(diǎn)關(guān)注以下問(wèn)題：對(duì)于采用ELISPOT方法的申報(bào)試劑，明確培養(yǎng)時(shí)所用外周血單個(gè)核細(xì)胞的數(shù)量以及所用培養(yǎng)基類型。

7.【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

結(jié)合陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照以及樣本管檢測(cè)結(jié)果，以列表的形式對(duì)所有可能出現(xiàn)的結(jié)果組合及相應(yīng)的解釋進(jìn)行詳述，明確灰區(qū)結(jié)果的處理方式。

8.【檢驗(yàn)方法的局限性】

8.1本試劑盒的檢測(cè)結(jié)果僅供臨床參考，對(duì)患者的臨床診治應(yīng)結(jié)合其癥狀/體征、病史、其他實(shí)驗(yàn)室檢查及治療反應(yīng)等情況綜合考慮。

8.2有關(guān)假陰性結(jié)果的可能性分析，如：某些免疫功能受損的患者，可能導(dǎo)致假陰性。

8.3有關(guān)假陽(yáng)性結(jié)果的可能性分析，如：與其他分枝桿菌是否存在交叉反應(yīng)。

9.【產(chǎn)品性能指標(biāo)】

9.1最低檢測(cè)限（如適用）：說(shuō)明試劑的最低檢出濃度，簡(jiǎn)單介紹最低檢測(cè)限的試驗(yàn)方法及結(jié)果。

9.2企業(yè)陰陽(yáng)性參考品的檢測(cè)符合情況：簡(jiǎn)單介紹陰陽(yáng)性參考品的組成和符合率結(jié)果等信息。

9.3精密度：明確精密度參考品的組成及結(jié)果。

9.4分析特異性

9.4.1交叉反應(yīng)：明確可能產(chǎn)生交叉反應(yīng)的其他細(xì)胞因子的驗(yàn)證情況。

9.4.2干擾物質(zhì)：明確樣本中常見(jiàn)干擾物質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。

9.5對(duì)比試驗(yàn)研究（如有）：簡(jiǎn)要介紹對(duì)比試劑（方法）的信息、所采用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法及統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。

9.6境外（如適用）和境內(nèi)臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)總結(jié)。

《結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(cè)試劑注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則》編制說(shuō)明

一、編制背景

結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(cè)試劑是指利用免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，如ELISA或ELISPOT技術(shù)等，以結(jié)核分枝桿菌特異抗原刺激T細(xì)胞產(chǎn)生的γ-干擾素為檢測(cè)靶標(biāo)，對(duì)人靜脈全血中的結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)進(jìn)行體外檢測(cè)的試劑，可用于結(jié)核分枝桿菌感染的檢測(cè)或用于結(jié)核病的輔助診斷。

本指導(dǎo)原則所述內(nèi)容是針對(duì)結(jié)核病輔助診斷預(yù)期用途的，對(duì)于預(yù)期用途為結(jié)核分枝桿菌感染檢測(cè)的申報(bào)試劑，申請(qǐng)人可以根據(jù)產(chǎn)品特性對(duì)不適用部分進(jìn)行修訂或補(bǔ)充其他的評(píng)價(jià)和驗(yàn)證。

二、重點(diǎn)問(wèn)題的說(shuō)明

（一）企業(yè)參考品的組成和樣本類型

目前，該類試劑采用全血樣本作為檢測(cè)樣本類型，所涉及的方法學(xué)包括：ELISPOT和ELISA。針對(duì)企業(yè)參考品的樣本類型，考慮到全血樣本的不可凍存性和該類試劑質(zhì)控的關(guān)鍵點(diǎn)，指導(dǎo)原則建議：如申請(qǐng)人采用除全血之外的其他樣本形式作為企業(yè)參考品，應(yīng)提交申請(qǐng)人所采用的企業(yè)參考品的組成、來(lái)源、穩(wěn)定性、延續(xù)性、性能可控性等詳細(xì)的理論和試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

針對(duì)企業(yè)參考品的組成，由于ELISPOT方法是在全血細(xì)胞培養(yǎng)后，直接在固體基質(zhì)表面形成斑點(diǎn)，計(jì)數(shù)斑點(diǎn)判斷結(jié)果，理論上可計(jì)數(shù)一個(gè)斑點(diǎn)。但在實(shí)踐時(shí)，很難保證獲取的全血樣本剛好形成一個(gè)斑點(diǎn)，因此，采用該方法學(xué)的試劑僅需要設(shè)置陰性參考品、陽(yáng)性參考品和精密度參考品。而ELISA方法是在全血培養(yǎng)后，吸出血漿上清，檢測(cè)上清中的干擾素的含量，因此，采用該方法學(xué)的此類試劑需要設(shè)置培養(yǎng)階段和干擾素ELISA檢測(cè)階段參考品，包括：陰性參考品、陽(yáng)性參考品、線性參考品、最低檢測(cè)限參考品和精密度參考品等。

（二）分析性能評(píng)估相關(guān)問(wèn)題

1.最低檢測(cè)限的要求與方法

采用ELISPOT方法的試劑，理論上可計(jì)數(shù)到一個(gè)斑點(diǎn)，因此理論上其最低檢測(cè)限為1個(gè)斑點(diǎn)，但現(xiàn)實(shí)中通過(guò)試驗(yàn)證明該類試劑的最低檢測(cè)限為1個(gè)斑點(diǎn)具有很大困難，難以實(shí)現(xiàn)。因此，參考美國(guó)FDA已批準(zhǔn)同類試劑的要求，經(jīng)討論后，對(duì)ELISPOT方法學(xué)的此類試劑，無(wú)需進(jìn)行最低檢測(cè)限的驗(yàn)證。

采用ELISA方法的試劑，最低檢測(cè)限檢測(cè)的是血漿樣本中干擾素的最低含量。指導(dǎo)原則建議，申請(qǐng)人可根據(jù)自己的研發(fā)平臺(tái)，設(shè)置科學(xué)合理的方法，進(jìn)行最低檢測(cè)限的試驗(yàn)。

2.精密度的要求與方法

采用ELISPOT方法的試劑，精密度必須采用全血進(jìn)行試驗(yàn)，方可模擬整個(gè)檢測(cè)過(guò)程。在討論日間精密度時(shí)，企業(yè)和相關(guān)專家均提出，因?yàn)槿獦颖緹o(wú)法凍存，無(wú)法在不同的自然天內(nèi)進(jìn)行日間精密度的研究。同時(shí)，現(xiàn)有認(rèn)知水平下，也無(wú)科學(xué)合理的替代方法來(lái)進(jìn)行日間精密度的研究，因此，對(duì)此類試劑不做日間精密度的要求。

采用ELISA方法的試劑，精密度不僅需要考察全血培養(yǎng)階段的精密度，而且需要考察ELISA檢測(cè)部分對(duì)干擾素含量檢測(cè)的精密度，前者可參考ELISPOT方法的相關(guān)要求和方法，后者參考常見(jiàn)ELISA方法檢測(cè)試劑的要求和方法。

3.交叉反應(yīng)的要求與方法

采用ELISPOT方法和ELISA方法的試劑，盡管結(jié)果的判讀方式存在差異，但其檢驗(yàn)原理均是采用特異性的γ-干擾素抗體，檢測(cè)T細(xì)胞刺激活化后分泌的γ-干擾素。因此，此類試劑的交叉反應(yīng)性，主要考慮全血自身含有的細(xì)胞因子或全血刺激培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的細(xì)胞因子與申報(bào)試劑所用γ-干擾素抗體對(duì)是否存在交叉反應(yīng)。

如果在全血樣本的培養(yǎng)過(guò)程中加入可能產(chǎn)生交叉反應(yīng)的細(xì)胞因子，勢(shì)必會(huì)影響T細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中的功能和活性，最終影響T細(xì)胞分泌γ-干擾素的能力，影響對(duì)結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)的檢測(cè)。因此，對(duì)于該類試劑，不管是采用何種方法，交叉反應(yīng)的研究都是采用血漿或其他基質(zhì)檢測(cè)細(xì)胞因子對(duì)γ-干擾素抗體對(duì)的交叉反應(yīng)性。

（三）產(chǎn)品預(yù)期用途

該類試劑的檢測(cè)原理可檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的感染，包括活動(dòng)性結(jié)核感染（結(jié)核病）和潛伏感染。但是，因?yàn)闈摲腥镜脑\斷在全世界均無(wú)金標(biāo)準(zhǔn)，而且中國(guó)人出生就接種卡介苗，導(dǎo)致對(duì)潛伏感染預(yù)期用途的臨床驗(yàn)證目前缺乏有效的對(duì)比方法，因此，目前申請(qǐng)人申報(bào)該類試劑的預(yù)期用途基本用于結(jié)核病的輔助診斷。本指導(dǎo)原則針對(duì)結(jié)核病輔助診斷預(yù)期用途的臨床試驗(yàn)要求，給出了較為詳細(xì)的建議，并經(jīng)專家和企業(yè)討論后，達(dá)成了一致意見(jiàn)。

同時(shí)，指導(dǎo)原則也明確，如果申請(qǐng)人對(duì)該類試劑的預(yù)期用途設(shè)定為結(jié)核分枝桿菌感染的檢測(cè)，需提供足夠的臨床證據(jù)支持該聲稱。

（四）臨床試驗(yàn)相關(guān)問(wèn)題

1.樣本入組相關(guān)要求

針對(duì)結(jié)核病輔助診斷的預(yù)期用途，指導(dǎo)原則在臨床試驗(yàn)樣本入組方面做了較為詳細(xì)的說(shuō)明。申報(bào)試劑應(yīng)選擇疑似結(jié)核患者進(jìn)行檢測(cè)，以模擬臨床實(shí)際使用情況。臨床使用中，該類試劑不僅用于肺結(jié)核的輔助診斷，還可用于肺外結(jié)核的輔助診斷，因此，指導(dǎo)原則對(duì)單純肺外結(jié)核的樣本例數(shù)也給出了最低要求。鑒于臨床實(shí)踐和研究證明，肺癌患者是一類與γ-干擾素相關(guān)的癌癥，因此，規(guī)定了肺癌患者的最低樣本例數(shù)，以考察該類試劑的特異性。

2.臨床特異性的相關(guān)要求

指導(dǎo)原則初稿時(shí)，對(duì)申報(bào)試劑的臨床特異性做出了不低于75%的要求。后經(jīng)專家和企業(yè)反復(fù)討論后刪除了這一要求，原因有以下幾點(diǎn)：第一，該類試劑已有多個(gè)同類產(chǎn)品在國(guó)內(nèi)外批準(zhǔn)上市，按照法規(guī)要求，可選擇已上市同類試劑，驗(yàn)證該類試劑的檢測(cè)準(zhǔn)確性；第二，該類試劑的臨床特異性受臨床試驗(yàn)受試人群的年齡、性別以及區(qū)域的影響較大，而且目前并無(wú)大量流行病學(xué)的調(diào)查數(shù)據(jù)支持75%的聲稱，因此，臨床特異性無(wú)法給出具體要求。

三、編寫單位

國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心。