乙型肝炎病毒基因分型檢測試劑注冊審查指導原則（2025年修訂版）（2025年第4號）

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乙型肝炎病毒基因分型檢測試劑注冊審查
指導原則（2025年修訂版）

本指導原則旨在指導注冊申請人對乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV）基因分型檢測試劑注冊申報資料的準備及撰寫，同時也為技術(shù)審評部門對注冊申報資料的技術(shù)審評提供參考。

本指導原則是對乙型肝炎病毒基因分型檢測試劑的一般要求，申請人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對注冊申報資料的內(nèi)容進行充實和細化。

本指導原則是供注冊申請人和技術(shù)審評人員使用的指導性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，亦不作為法規(guī)強制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細的研究資料和驗證資料，相關(guān)人員應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現(xiàn)行法規(guī)、標準體系以及當前認知水平下制定的，隨著法規(guī)和標準的不斷完善以及科學技術(shù)的不斷發(fā)展，相關(guān)內(nèi)容也將適時進行調(diào)整。

一、適用范圍

本指導原則適用于采用實時熒光 PCR法，對人血清、血漿樣本中的乙型肝炎病毒進行基因分型的檢測試劑。

對于采用其他分子生物學方法或其他樣本類型的乙型肝炎病毒基因分型檢測試劑，可能部分要求不完全適用或本文所述內(nèi)容不夠全面，申請人可參照本指導原則，根據(jù)產(chǎn)品特性對適用部分進行評價，并補充其他的評價資料。

HBV屬嗜肝DNA病毒科，基因組長約3.2kb，為部分雙鏈環(huán)狀DNA。根據(jù)全基因組序列差異>8%或S基因序列差異>4%的標準，可將其分為不同的基因型。目前HBV至少有9 種（A 型至I 型）基因型和1種未定基因型（J 型）。

不同基因型的HBV在耐藥性、致病力及基因突變頻率等方面存在一定差別，導致不同基因型HBV感染者的疾病嚴重程度、藥物治療反應(yīng)和最終結(jié)局不同，因此在確認HBV感染后進行基因型檢測有助于指導臨床選擇用藥。

本指導原則適用于乙型肝炎病毒基因分型檢測試劑注冊申請和變更注冊申請的情形。本指導原則僅針對乙型肝炎病毒基因分型檢測試劑注冊申報資料中的部分內(nèi)容進行撰寫，其他未盡事宜應(yīng)當符合《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告》等相關(guān)法規(guī)要求。

二、注冊審查要點

（一）監(jiān)管信息

1. 產(chǎn)品名稱及分類編碼

產(chǎn)品名稱應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》及相關(guān)法規(guī)的要求，如乙型肝炎病毒基因分型檢測試劑盒（熒光PCR法）。根據(jù)《體外診斷試劑分類目錄》，該產(chǎn)品按照第三類體外診斷試劑管理，分類編碼為6840。

2. 其他信息還包括產(chǎn)品列表、關(guān)聯(lián)文件、申報前與監(jiān)管機構(gòu)的聯(lián)系情況和溝通記錄以及符合性聲明等文件。

（二）綜述資料

綜述資料主要包括概述、產(chǎn)品描述、預(yù)期用途、申報產(chǎn)品上市歷史及其他需說明的內(nèi)容。應(yīng)詳細說明產(chǎn)品所采用的技術(shù)原理及檢測流程。提供不同適用機型的檢測通量，即一次檢測最多可檢測的樣本數(shù)。提供核酸提?。ㄊ止ず妥詣犹崛》绞綉?yīng)分別明確）和PCR擴增的時間，以及檢測全過程所需的時間。不同檢測流程，分別提供最少和最多檢測樣本量下的檢測時間。與已上市同類產(chǎn)品進行比較應(yīng)著重從方法學及不同基因型檢出能力等方面寫明擬申報產(chǎn)品與目前市場上已獲批準的同類產(chǎn)品之間的主要區(qū)別，比較內(nèi)容包括樣本類型，檢測原理，檢測靶基因，組成成分，內(nèi)標，質(zhì)控品，判讀規(guī)則，分析性能和臨床性能等。

（三）非臨床資料

1. 產(chǎn)品技術(shù)要求及檢驗報告

注冊申請人應(yīng)當在原材料質(zhì)量和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的前提下，根據(jù)產(chǎn)品研制、前期評價等結(jié)果，依據(jù)國家標準、行業(yè)標準及有關(guān)文獻資料，結(jié)合產(chǎn)品特性按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導原則》的要求編寫產(chǎn)品技術(shù)要求。該類產(chǎn)品作為第三類體外診斷試劑，應(yīng)當以附錄形式明確主要原材料及生產(chǎn)工藝要求。

如已有相應(yīng)型別的國家標準品，技術(shù)要求中應(yīng)體現(xiàn)國家標準品的相關(guān)要求。

如果有適用的國家標準、行業(yè)標準，產(chǎn)品技術(shù)要求的相關(guān)要求應(yīng)不低于相應(yīng)的要求。

2. 分析性能研究

注冊申請人應(yīng)采用在符合質(zhì)量管理體系的環(huán)境下生產(chǎn)的試劑盒進行所有分析性能研究，提交具體研究方法、試驗方案、試驗數(shù)據(jù)、統(tǒng)計分析等詳細資料。

分析性能評估所用樣本的基本信息均需明確，例如樣本來源、樣本類型、采集和處理方式、稀釋方式、定值過程及數(shù)據(jù)等。分析性能評估所用的樣本，至少B、C、D型乙型肝炎病毒應(yīng)為真實樣本或病毒培養(yǎng)物，對于難以獲得的罕見型別可采用質(zhì)粒或假病毒。如涉及稀釋后檢測，應(yīng)采用與適用樣本類型一致的陰性基質(zhì)進行稀釋。對于各項性能中使用的樣本，在下述各項性能研究資料中分別提供樣本信息列表。

2.1樣本穩(wěn)定性

樣本穩(wěn)定性研究包括采集后未經(jīng)處理的樣本和核酸提取純化后的DNA樣本，研究內(nèi)容包括冷藏保存時間，冷凍保存時間，凍融次數(shù)等。

2.2適用的樣本類型

列明產(chǎn)品適用的樣本類型。

2.3準確度

采用申報試劑與核酸測序或已上市產(chǎn)品，同時檢測臨床樣本，比較檢測結(jié)果之間的一致性程度，進行申報試劑的準確度評價。

樣本應(yīng)選擇符合樣本穩(wěn)定性的預(yù)期人群樣本。研究應(yīng)納入一定數(shù)量的陰性和陽性樣本，應(yīng)覆蓋常見的基因型別。

2.4企業(yè)參考品驗證

根據(jù)主要原材料研究資料中的企業(yè)參考品設(shè)置情況，采用三批產(chǎn)品對企業(yè)參考品進行檢驗并提供詳細的試驗數(shù)據(jù)。

2.5精密度

應(yīng)對精密度指標，如標準差或變異系數(shù)等評價標準做出合理要求。應(yīng)考慮運行、時間、操作者、儀器、試劑批次和地點等影響精密度的條件，設(shè)計合理的精密度試驗方案。

精密度評價試驗應(yīng)包含核酸提取步驟。設(shè)定合理的精密度評價周期。例如為期至少20天的檢測。對檢測數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，獲得重復(fù)性、實驗室內(nèi)精密度、實驗室間精密度、批間精密度等結(jié)果。

應(yīng)采用臨床樣本進行精密度評價，應(yīng)至少包含3個水平：陰性樣本、檢出限水平樣本、中/強陽性樣本，并根據(jù)產(chǎn)品特性設(shè)定適當?shù)木芏纫螅纾?/p>

陰性樣本：不含待測物或待測物濃度為零時，陰性符合率應(yīng)為100%（n≥20）。

檢出限水平樣本：檢出限水平樣本陽性檢出率應(yīng)≥95%（n≥20）。

中/強陽性樣本：待測物濃度呈中度到強陽性，陽性符合率為100%，且Ct值的CV≤5%（n≥20）。

2.6檢出限

2.6.1檢出限的確定

建議將不同來源的至少3例乙型肝炎病毒樣本分別梯度稀釋于與適用樣本一致的基質(zhì)中，進行檢出限的確定。每個濃度梯度重復(fù)檢測不少于20次，將具有95%陽性檢出率的濃度水平作為檢出限。

在進行檢出限確定時申請人應(yīng)對申報產(chǎn)品聲稱可檢測的乙型肝炎病毒的不同基因型分別進行研究。

2.6.2檢出限的驗證

另外選擇具有時間和區(qū)域特征性的至少3個臨床樣本或病毒培養(yǎng)物在檢出限濃度水平進行驗證，進行至少20次重復(fù)檢測，應(yīng)達到95%陽性檢出率。

申請人應(yīng)對申報產(chǎn)品聲稱可檢測的乙型肝炎病毒的不同基因型的檢出限分別進行驗證。

應(yīng)提供詳細的病毒滴度/濃度的確定方法，同時應(yīng)詳細描述病毒樣本的確認方法及驗證結(jié)果。

2.7基因混合型的研究

該部分研究主要目的是考查申報試劑檢測不同濃度混合型樣本的能力。申請人應(yīng)設(shè)置不同濃度比例的混合型樣本進行驗證。

因理想的不同濃度比例基因混合型樣本在臨床單位中難以收集，申請人可以使用臨床模擬樣本進行驗證。該部分樣本建議用核酸測序方法和/或其他已上市產(chǎn)品明確樣本中包含的所有基因型，同時應(yīng)使用核酸定量的方法確定不同基因型的濃度。

2.8分析特異性

2.8.1交叉反應(yīng)

用于乙型肝炎病毒基因分型檢測試劑交叉反應(yīng)驗證的病原體種類主要考慮以下幾方面：

核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的臨床癥狀、采樣部位正常寄生或易并發(fā)的其他病原體。

申報產(chǎn)品聲稱可檢測的不同基因型以及其他基因型乙型肝炎病毒對被檢測基因型的影響。對于難以獲得的基因型, 可采用針對該基因型構(gòu)建的質(zhì)粒進行交叉驗證。

建議在病原體感染的醫(yī)學相關(guān)水平對乙型肝炎病毒核酸陰性樣本進行交叉反應(yīng)的驗證。通常，病毒為105 PFU/mL或更高，細菌為106CFU/mL或更高。

申請人應(yīng)提供所有用于交叉反應(yīng)驗證的病毒和細菌的來源、種屬/型別和濃度確認等試驗資料。有關(guān)交叉反應(yīng)驗證的信息應(yīng)在產(chǎn)品說明書的【產(chǎn)品性能指標】項中有所體現(xiàn)。

2.8.2微生物干擾

申請人應(yīng)充分考慮臨床上容易與乙型肝炎病毒合并感染的病原微生物以及申報產(chǎn)品檢測范圍外的不同基因型的乙型肝炎病毒，在高濃度的情況下對低濃度（例如檢出限濃度）被測基因型乙型肝炎病毒檢測的影響。

2.8.3競爭性干擾

申請人應(yīng)充分考慮臨床上常見存在的乙型肝炎病毒不同基因型混合感染情況，評價高濃度被測分析物對低濃度被測分析物檢測結(jié)果的影響。建議申請人結(jié)合申報試劑的反應(yīng)模式，使用一種基因型最低檢出限濃度的靶標乙型肝炎病毒和另一種基因型高濃度靶標乙型肝炎病毒評估競爭性干擾，競爭性干擾的乙型肝炎病毒基因型別組合建議為同一反應(yīng)體系內(nèi)常見不同基因型混合感染的乙型肝炎病毒。

2.8.4干擾物質(zhì)

應(yīng)根據(jù)所采集樣本類型，針對可能存在的內(nèi)源/外源物質(zhì)干擾情況進行驗證。

內(nèi)源性干擾物質(zhì)：樣本中常見干擾物質(zhì)對檢測結(jié)果的影響，如血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素、免疫球蛋白G等。

外源性干擾物質(zhì)：常用抗凝劑，臨床常用抗病毒藥物如：干擾素、拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋、替比夫定、富馬酸替諾福韋酯（TDF）、富馬酸丙酚替諾福韋酯（TAF）、艾米替諾福韋（TMF）等。

建議在乙型肝炎病毒的檢出限附近水平對每種干擾物質(zhì)的干擾影響進行檢測。干擾物濃度的分布應(yīng)覆蓋人體生理及病理狀態(tài)下可能出現(xiàn)的物質(zhì)濃度。應(yīng)注明不同干擾物質(zhì)對檢測物質(zhì)無干擾的最高限值?！　?/p>

2.9核酸提取/純化性能

在進行核酸檢測之前，建議有核酸提取/純化步驟。該步驟的目的除最大量分離出目的DNA外，還應(yīng)有相應(yīng)的純化作用，盡可能去除PCR抑制物。對配合使用的所有核酸提取試劑進行提取核酸純度、濃度、提取效率的研究，必要時可考慮與質(zhì)量較好的核酸提取試劑進行平行比對。若產(chǎn)品適用兩種或以上核酸提取試劑，則每一種核酸提取試劑均需配合檢測試劑進行抗干擾、精密度和檢出限的驗證。

2.10反應(yīng)體系

研究確定最佳核酸提取和反應(yīng)體系，包括核酸提取用的樣本體積、洗脫體積）和PCR加樣體積、各種酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度及反應(yīng)各階段溫度、時間、循環(huán)數(shù)等。建議在保證核酸提取質(zhì)量的情況下盡量擴大總反應(yīng)體系和加樣量，以提高檢測靈敏度。

提交不同適用機型基線和閾值循環(huán)數(shù)的確定資料。

不同適用機型的反應(yīng)條件如果有差異應(yīng)分別詳述，并提交驗證資料。

3. 穩(wěn)定性研究

申報試劑的穩(wěn)定性主要包括實時穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性、運輸穩(wěn)定性、機載穩(wěn)定性（如適用）及凍融次數(shù)限制等，申請人可根據(jù)實際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括具體的實施方案、詳細的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。對于實時穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

4. 陽性判斷值研究

用于陽性判斷值研究的樣本需具有多樣性和代表性，應(yīng)考慮不同年齡、地域、型別、不同感染階段等因素，盡量納入含有干擾物質(zhì)或其他易引起交叉反應(yīng)病原體的樣本。建議申請人采用受試者工作特征（ROC）曲線的方式對申報產(chǎn)品進行陽性判斷值研究。如存在判定值灰區(qū)，應(yīng)提供灰區(qū)的確認資料。如采用其他方法對陽性判斷值進行確認研究，應(yīng)說明這種方法的合理性。對于此類試劑，正常人群及其他患病人群中一般不應(yīng)檢出HBV基因型。

如果產(chǎn)品適用不同樣本類型，且檢測結(jié)果不具有可比性，需要對各樣本類型進行陽性判斷值的驗證。

提交陽性判斷值研究所用樣本的背景信息列表，至少包括樣本來源機構(gòu)、臨床診斷信息、性別、年齡等信息。

提供內(nèi)標檢測結(jié)果范圍的確定方法和研究資料。

5. 其他資料

5.1主要原材料研究資料

該類產(chǎn)品的主要原材料包括引物、探針、酶、dNTP、核酸分離/純化組分（如有）、質(zhì)控品、參考品等。應(yīng)提供主要原材料的選擇與來源、制備過程、質(zhì)量控制標準等相關(guān)研究資料、質(zhì)控品的定值試驗資料等。如主要原材料為企業(yè)自制，應(yīng)提供其詳細制備過程；如主要原材料源于外購，應(yīng)提供資料包括：選擇該原材料的依據(jù)及對比篩選試驗資料、生產(chǎn)商提供的質(zhì)量標準、出廠檢驗報告，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗資料。生產(chǎn)商應(yīng)固定，不得隨意更換。

5.1.1引物和探針：應(yīng)詳述引物和探針的設(shè)計原則，提供引物、探針核酸序列、靶序列的基因位點及兩者的對應(yīng)情況。建議每種基因型的病毒設(shè)計兩套或多套引物、探針以供篩選，通過序列比對和功能性試驗等方式，對病毒進行包容性和特異性（如交叉反應(yīng)）的評價，其中序列比對包括與已公布乙型肝炎病毒序列的比對，及與易產(chǎn)生交叉反應(yīng)的其他病原體的序列比對；功能性試驗包括對不同來源、不同滴度/濃度的乙型肝炎病毒不同基因型別陽性樣本，和不同的近緣病原體的檢測。通過篩選確定最佳的引物和探針組合。引物、探針的質(zhì)量標準應(yīng)至少包括序列準確性、純度、濃度及功能性試驗等。

5.1.2脫氧三磷酸核苷（dNTP）：包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP，應(yīng)提供對其純度、濃度、功能性等的詳細驗證資料。

5.1.3酶：需要的酶主要包括DNA聚合酶、尿嘧啶DNA糖基化酶等，應(yīng)分別對酶活性、功能性等進行評價和驗證。

5.1.4質(zhì)控品

試劑盒一般包含陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品。陽性質(zhì)控品應(yīng)包含試劑盒檢測的靶序列，可采用質(zhì)粒、假病毒等制備。質(zhì)控品需參與樣本處理、核酸的平行提取和檢測的全過程，以對整個提取和PCR擴增過程、試劑/設(shè)備、交叉污染等環(huán)節(jié)進行合理質(zhì)量控制。提交試劑盒質(zhì)控品有關(guān)原料選擇、制備、定值過程、濃度范圍等試驗資料，對質(zhì)控品的檢測結(jié)果Ct值范圍做出明確的要求。

5.1.5內(nèi)標

內(nèi)標，又稱內(nèi)對照，可對管內(nèi)抑制導致的假陰性結(jié)果進行質(zhì)量控制，應(yīng)與靶核酸一同提取及擴增。申請人需對內(nèi)標的引物、探針設(shè)計和相關(guān)反應(yīng)體系的濃度做精確驗證，既要保證內(nèi)標熒光通道呈明顯的陽性曲線又要盡量降低對靶基因檢測造成的抑制。明確內(nèi)標的檢測結(jié)果Ct值范圍。

5.1.6企業(yè)參考品

該類產(chǎn)品的企業(yè)參考品一般包括陽性參考品、陰性參考品、檢出限參考品和精密度參考品。應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品性能驗證的實際需要設(shè)置企業(yè)參考品。

應(yīng)提交企業(yè)參考品的原料來源、選擇、制備、陰陽性及濃度確認方法或試劑等相關(guān)驗證資料。企業(yè)參考品建議采用滅活病毒的臨床樣本或病毒培養(yǎng)物，罕見型別可采用質(zhì)?；蚣俨《?。企業(yè)參考品的設(shè)置建議如下：

陽性參考品：陽性參考品應(yīng)包含申報產(chǎn)品聲稱能檢測的所有基因型，每個基因型應(yīng)設(shè)置不同濃度水平，至少設(shè)置兩個濃度水平（弱陽性、中或強陽性）；常見基因型陽性參考品設(shè)置建議采用滅活病毒的血清/血漿。

陰性參考品：可采用經(jīng)確認無目標靶基因序列的樣本。陰性參考品可反映非特異擴增或檢測過程，當不存在目標序列時不會得到相關(guān)信號。陰性參考品設(shè)置建議采用滅活的血清/血漿。

檢出限參考品：可采用95%陽性檢出水平或略高于檢出限的水平，如100%陽性檢出水平。應(yīng)針對申報產(chǎn)品聲稱可檢出的所有基因型乙型肝炎病毒進行設(shè)置。

精密度參考品：建議包括高、低兩個濃度的樣本，其中一個濃度應(yīng)為檢出限附近的濃度。

5.2生產(chǎn)工藝研究資料

介紹產(chǎn)品主要生產(chǎn)工藝，可用流程圖結(jié)合文字的方式表述。提交主要生產(chǎn)工藝的確定及優(yōu)化研究資料。

（四）臨床評價資料

1.試驗方法

乙型肝炎病毒基因分型檢測試劑目前主要供臨床醫(yī)生對慢性乙型肝炎患者設(shè)置臨床治療方案提供參考依據(jù)。隨著乙型肝炎基因型與肝炎病情關(guān)系的研究工作不斷深入，研究方法不斷改進，新的研究成果可能將被轉(zhuǎn)化應(yīng)用于臨床工作中。如乙型肝炎病毒基因分型檢測試劑用于新的臨床用途，應(yīng)根據(jù)新的臨床用途特點設(shè)置具有針對性的臨床試驗研究方案。

對比方法的選擇可以考慮以下幾方面：

1.1 如已有同類產(chǎn)品上市，應(yīng)選擇境內(nèi)已批準上市的同類產(chǎn)品作為對比試劑，采用試驗體外診斷試劑與之進行比較研究，評價試驗體外診斷試劑與已上市同類產(chǎn)品之間的一致性。應(yīng)充分考慮已上市同類產(chǎn)品的型別選擇、靶序列選擇、檢出限等特性，確保對比試劑與申報試劑具有明確可比性。

1.2 如無已上市同類產(chǎn)品，申請人可采用核酸序列測定方法作為此類試劑臨床試驗研究的對比方法，評價試驗體外診斷試劑檢測結(jié)果與測序結(jié)果之間的一致性。臨床試驗報告中應(yīng)對選用的測序方法做詳細介紹。

申請人應(yīng)提供以下關(guān)于測序部分的詳細試驗資料，需有臨床試驗機構(gòu)簽章確認：

1.2.1 測序方法原理、測序儀型號、測序試劑及消耗品的相關(guān)信息。

1.2.2 測序方法所用引物相關(guān)信息，如基因區(qū)段選擇，分子量、純度、功能性實驗等資料。引物設(shè)計應(yīng)合理涵蓋申報試劑擴增的靶核酸區(qū)段、位點及所有突變類型。

1.2.3 對所選測序方法的分析性能進行合理驗證，尤其是檢出限的確認，建議將所選測序方法與申報試劑的相關(guān)性能進行適當比對分析。

1.2.4 測序方法應(yīng)建立合理的陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品對臨床樣本的檢測結(jié)果進行質(zhì)量控制。

1.2.5 提交有代表性的樣本測序圖譜及結(jié)果分析資料。

2.臨床試驗機構(gòu)的選擇

應(yīng)選擇不少于3家（含3家）已備案的臨床試驗機構(gòu)，按照相關(guān)法規(guī)、指導原則的要求開展臨床試驗。建議申請人在選擇臨床試驗機構(gòu)時，應(yīng)考慮試驗機構(gòu)之間的地域代表性，臨床試驗機構(gòu)應(yīng)具有分子生物學方法檢測的優(yōu)勢，實驗操作人員應(yīng)有足夠的時間熟悉檢測系統(tǒng)的各環(huán)節(jié)（儀器、試劑、質(zhì)控及操作程序等），熟悉臨床試驗方案。在整個實驗中，試驗體外診斷試劑和對比試劑都應(yīng)處于有效的質(zhì)量控制下，最大限度保證實驗數(shù)據(jù)的準確性及可重復(fù)性。

3.臨床試驗方案

臨床試驗實施前，研究人員應(yīng)從流行病學、統(tǒng)計學、臨床醫(yī)學、檢驗醫(yī)學等多方面考慮，設(shè)計科學合理的方案。各臨床試驗機構(gòu)的方案設(shè)置應(yīng)基本一致，且保證在整個臨床試驗過程中遵循預(yù)定的方案實施，不可隨意改動。整個試驗過程應(yīng)在臨床試驗機構(gòu)的實驗室內(nèi)并由本實驗室的技術(shù)人員操作完成，申報單位的技術(shù)人員除進行必要的技術(shù)指導外，不得隨意干涉試驗進程，尤其是數(shù)據(jù)收集過程。

試驗方案中應(yīng)確定嚴格的病例納入/排除標準，任何已經(jīng)入選的病例再被剔除的樣本都應(yīng)記錄在案，并明確說明原因。在試驗操作過程中和判定試驗結(jié)果時應(yīng)采用盲法以保證試驗結(jié)果的客觀性。

4.臨床試驗對象選擇

4.1基因型方面的考慮

HBV病毒其基因具有顯著的多樣性，不同的地區(qū)和民族，HBV流行的基因型不同。境內(nèi)流行的HBV基因型主要為B型、C型，部分地區(qū)存在少數(shù)D 型，以及重組型基因C/D型、B/C型、B/D型等。而且，HBV基因型具有一定的地域差異，不同地區(qū)流行的HBV基因型也不盡相同。因此，在選擇HBV感染者病例時，首先應(yīng)根據(jù)HBV流行的情況，選擇能代表我國不同地區(qū)流行基因型的HBV感染者病例，以對試劑檢測我國流行的HBV病毒的能力進行客觀科學的評價，選擇的基因型應(yīng)包括上述三種主要的基因型。

4.2病例選擇及樣本量

臨床試驗的入組病例應(yīng)以確診的慢性乙型肝炎病毒感染者為主，涵蓋注冊申報試劑所聲稱的所有基因型。對于B型及C型基因型臨床樣本，建議每種基因型不少于200例臨床樣本；對于D型基因型及其他基因型臨床樣本，建議每種不少于30例陽性病例。每種基因型臨床樣本應(yīng)來源于乙型肝炎病毒核酸檢測陽性的患者。如注冊申報試劑中包含其他基因型，應(yīng)結(jié)合這部分基因型在我國的流行病學特點，臨床應(yīng)用情況等綜合因素，對其臨床有效性進行科學評估。

在樣本選擇時，應(yīng)注重患者來源的不同地域性，不同病情進展，不同藥物治療方案等。同時應(yīng)選擇部分干擾樣本（交叉反應(yīng)樣本），對于干擾樣本的選擇，應(yīng)考慮到在檢測過程中容易產(chǎn)生干擾，可能造成假陽性/假陰性的情況，以從臨床角度考察其分析特異性。

5.統(tǒng)計學分析

對臨床試驗結(jié)果的統(tǒng)計應(yīng)選擇合適的統(tǒng)計方法，對于申報產(chǎn)品與對比方法的一致性評價，常選擇交叉四格表的形式總結(jié)兩種方法的結(jié)果，評價指標一般包括陽性符合率/靈敏度、陰性符合率/特異度，Kappa值等，并計算相應(yīng)的95%置信區(qū)間。除進行總體統(tǒng)計外，還應(yīng)針對各基因型進行分層統(tǒng)計。

6.結(jié)果差異樣本的驗證

在數(shù)據(jù)收集過程中，對于兩種試劑的檢測結(jié)果有不一致的樣本，如有必要，應(yīng)采用臨床上公認較好的第三種同類試劑或參考方法對結(jié)果進行確認，同時結(jié)合患者的臨床病情對差異原因及可能結(jié)果進行分析。

7.臨床試驗小結(jié)與報告的撰寫

根據(jù)《醫(yī)療器械臨床試驗質(zhì)量管理規(guī)范》《體外診斷試劑臨床試驗技術(shù)指導原則》的要求，撰寫臨床試驗小結(jié)與報告，并且滿足簽章等要求。臨床試驗報告應(yīng)該對試驗的整體設(shè)計及各個關(guān)鍵點給予清晰、完整的闡述，應(yīng)該對整個臨床試驗實施過程、結(jié)果分析、結(jié)論等進行條理分明的描述，并應(yīng)包括必要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計分析方法。

（五）產(chǎn)品說明書和標簽樣稿

產(chǎn)品說明書格式應(yīng)滿足《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》的要求。產(chǎn)品說明書中技術(shù)內(nèi)容應(yīng)與注冊申報資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致，如某些內(nèi)容引用自參考文獻，應(yīng)以規(guī)范格式進行標注，并單獨列明文獻的相關(guān)信息。乙型肝炎病毒基因分型檢測試劑說明書編寫應(yīng)重點關(guān)注以下內(nèi)容。

1.【預(yù)期用途】

1.1試劑盒用于體外定性檢測已明確為乙型肝炎病毒核酸陽性患者的血清、血漿等樣本中乙型肝炎病毒基因型。輔助醫(yī)療專業(yè)人員了解病人的乙型肝炎病毒基因型感染情況以及確定適當?shù)闹委煼椒ā?/p>

1.2 乙型肝炎病毒基因分型檢測試劑的基因型應(yīng)至少包括B型、C型、D型，如果申請人略去上述任意一種推薦的基因型，應(yīng)給出合理的解釋。

1.3 適用人群：確診的慢性乙型肝炎病毒感染者。

1.4 簡要介紹乙型肝炎病毒基因型的特征，包括不同基因型的特征、常見亞型、不同基因型在地域及人群中的分布情況、不同基因型在臨床的應(yīng)用特點。

1.5 強調(diào)該試劑盒檢測結(jié)果僅供臨床參考，不應(yīng)作為治療藥物調(diào)整的唯一依據(jù)，臨床醫(yī)生應(yīng)結(jié)合患者病情及其他實驗室檢測指標等因素對患者治療進行綜合判斷。

2.【檢驗原理】

2.1 對試劑盒能夠檢測的所有基因型進行詳細描述（靶序列長度及來源區(qū)段、基因型及相關(guān)特征等），對引物及探針設(shè)計、不同樣品反應(yīng)管組合、對照品設(shè)置及熒光信號檢測原理等進行逐項介紹。

2.2 核酸提取純化的方法、原理等。

2.3 試劑盒技術(shù)原理的詳細介紹，建議結(jié)合適當圖示進行說明。如反應(yīng)體系中添加了相關(guān)的防污染組分（如UNG酶），也應(yīng)對其作用機理作適當介紹。

3.【主要組成成分】

明確試劑盒中各組分及具體成分。明確需要但未提供的材料，例如核酸提取試劑等的產(chǎn)品名稱，生產(chǎn)廠家，貨號或注冊證號、備案號等信息。

4.【適用機型】

注明所有適用的儀器型號，并提供與儀器有關(guān)的重要信息以指導用戶操作。

5.【儲存條件及有效期】

試劑盒的效期穩(wěn)定性等，明確具體的儲存條件及有效期等信息。

6.【樣本要求】

6.1 樣本收集要求：如采集時間、采集順序等，是否受臨床癥狀、用藥情況等因素的影響。結(jié)合臨床需要并參照慢性乙型肝炎防治指南（現(xiàn)行版）相關(guān)要求。

6.2 血液樣本應(yīng)當說明對采血管及抗凝劑的要求：明確樣本類型、采血管和抗凝劑，其他樣本應(yīng)說明樣本采集、處理及保存方式。

6.3 樣本處理、運送及保存：核酸提取前的預(yù)處理、運送條件、保存條件及期限等。冷藏/冷凍樣本檢測前是否需恢復(fù)至室溫，凍融次數(shù)的要求。

7.【檢驗方法】

明確核酸提取用的體積、洗脫體積和PCR加樣體積，陰、陽性質(zhì)控品與待測樣本同步進行核酸提取操作。明確各適用機型的反應(yīng)參數(shù)設(shè)置。明確質(zhì)控品和內(nèi)標品的檢測結(jié)果Ct值范圍，作為試驗有效性的標準。

8.【檢驗結(jié)果的解釋】

結(jié)合陽性對照、陰性對照和內(nèi)標的檢測結(jié)果，通過樣本的擴增曲線和Ct值進行結(jié)果陰陽性的判斷，列明結(jié)果陰性、陽性、復(fù)測、無效等所有情形。

9.【檢驗方法的局限性】

9.1 該產(chǎn)品僅用于乙型肝炎病毒核酸檢測陽性患者的臨床樣本檢測。

9.2 該產(chǎn)品僅用于不同基因型的定性檢測，不適用定量檢測。

9.3該產(chǎn)品未包含全部乙型基因型別。該產(chǎn)品僅用于產(chǎn)品說明書預(yù)期用途所包含的已知基因型的檢測，不適用其他基因型及未知基因型的檢測。因此，當本試劑盒檢測結(jié)果為陰性時，并不能排除被檢測者帶有乙型肝炎病毒的其他基因位點。

9.4 該類產(chǎn)品基于檢測原理無法準確檢測乙型肝炎病毒基因重組型樣本的結(jié)果，無法對乙型肝炎病毒基因混合型樣本和重組型樣本進行有效區(qū)分。

9.5 模板DNA質(zhì)量將影響該產(chǎn)品檢測結(jié)果。模板DNA 的質(zhì)量可能受樣本來源、采集過程、運輸條件、樣本處理等因素影響，同時也受DNA提取方法、PCR儀類型、操作環(huán)境以及當前分子生物學技術(shù)的局限性等的限制，可能導致出現(xiàn)假陽性和假陰性的檢測結(jié)果。使用者須了解檢測過程中可能存在的潛在風險。

9.6 該產(chǎn)品以乙型肝炎病毒基因上的特定DNA片段為檢測靶標，如試劑盒引物與探針結(jié)合區(qū)出現(xiàn)基因突變，導致檢測結(jié)果異常，將影響檢測結(jié)果解釋。

10.【產(chǎn)品性能指標】

詳述以下性能指標：

10.1檢出限：說明試劑對不同樣本類型及不同基因型的檢出限，簡要介紹檢出限的確定方法以及對檢出限驗證所采用的基因型。如不同基因型之間檢出限不同，應(yīng)分別列出。

10.2 精密度：精密度參考品的組分、濃度及評價標準、評價結(jié)果。

10.3 特異性：

10.3.1交叉反應(yīng)：

易產(chǎn)生交叉反應(yīng)的其他病原體以及乙型肝炎病毒其他基因型的驗證情況，建議以列表的方式表示經(jīng)過交叉反應(yīng)驗證的病原體名稱、型別、濃度等信息。

10.3.2干擾物質(zhì)：樣本中常見干擾物質(zhì)對檢測結(jié)果的影響。

10.3.3藥物影響：常用抗病毒藥物、干擾素等對檢測結(jié)果的影響，如未進行相關(guān)研究也應(yīng)提供相關(guān)警示說明。

10.4臨床試驗：介紹試驗方法、受試者及樣本、試驗結(jié)果和結(jié)論等。

11.【注意事項】

應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：

11.1 如該產(chǎn)品含有人源或動物源性物質(zhì)，應(yīng)給出具有潛在感染性的警告。

11.2 臨床實驗室應(yīng)嚴格按照《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法》等有關(guān)分子生物學實驗室、臨床基因擴增實驗室的管理規(guī)范執(zhí)行。

三、參考文獻：

[1]國家市場監(jiān)督管理總局.體外診斷試劑注冊與備案管理辦法:國家市場監(jiān)督管理總局令第48號[Z].

[2]國家藥品監(jiān)督管理局.關(guān)于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告:國家藥品監(jiān)督管理局公告2021年第122號[Z].

[3]國家藥品監(jiān)督管理局.體外診斷試劑臨床試驗技術(shù)指導原則:國家藥品監(jiān)督管理局2021年第72號[Z].

[4]國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心.定性檢測體外診斷試劑分析性能評估注冊審查指導原則:國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心2022年第36號[Z].

[5]中華醫(yī)學會肝病學分會，中華醫(yī)學會感染病學分會.慢性乙型肝炎防治指南2022年版. 傳染病信息，2023,36:1-17.