寨卡病毒核酸檢測試劑注冊審查指導原則（2024年第1號）

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寨卡病毒核酸檢測試劑注冊審查指導原則

本指導原則旨在指導注冊申請人對寨卡病毒核酸檢測試劑注冊申報資料的準備及撰寫(xiě)，同時(shí)也為技術(shù)審評部門(mén)提供參考。

本指導原則是對寨卡病毒核酸檢測試劑的一般要求，申請人應依據產(chǎn)品的具體特性確定其中內容是否適用。若不適用，需具體闡述理由及相應的科學(xué)依據，并依據產(chǎn)品的具體特性對注冊申報資料的內容進(jìn)行充實(shí)和細化。

本指導原則是供注冊申請人和技術(shù)審評人員使用的指導性文件，但不包括審評審批所涉及的行政事項，亦不作為法規強制執行，應在遵循相關(guān)法規的前提下使用本指導原則。如果有能夠滿(mǎn)足相關(guān)法規要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細的研究資料和驗證資料。

本指導原則是在現行法規和標準體系以及當前認知水平下制定，隨著(zhù)法規和標準的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，相關(guān)內容也將適時(shí)進(jìn)行調整。

一、適用范圍

寨卡病毒屬于黃病毒科黃病毒屬，呈球形，直徑約為40-70nm，有包膜?；蚪M為單股正鏈RNA，長(cháng)度約為10.8Kb，兩端為非編碼區，內部的單一開(kāi)放讀碼框依次編碼3種結構蛋白，包括衣殼蛋白（C）、膜蛋白前體/膜蛋白（prM/M）、包膜蛋白（E）和7種非結構蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5），根據基因組序列不同分為亞洲型和非洲型兩個(gè)基因型。

寨卡病毒病的檢測方法包括病毒核酸檢測、病毒抗原檢測、IgM和IgG抗體檢測、中和抗體檢測和病毒分離培養等。寨卡病毒與黃病毒屬其他病毒具有較強的血清學(xué)交叉反應，目前主要采用病毒核酸檢測。核酸檢測主要采用逆轉錄實(shí)時(shí)熒光PCR、恒溫擴增等方法，檢測樣本類(lèi)型包括血清、血漿、尿液、精液或唾液等。

本指導原則適用于采用逆轉錄實(shí)時(shí)熒光PCR法，對血清、血漿、尿液、精液或唾液等樣本中的寨卡病毒核酸進(jìn)行體外定性檢測的試劑。

對于采用其他方法學(xué)的寨卡病毒核酸檢測試劑，可能部分要求不完全適用或本文所述內容不夠全面，申請人應參照本指導原則，根據產(chǎn)品特性對適用部分進(jìn)行評價(jià)，并補充其他的評價(jià)資料。

本指導原則適用于寨卡病毒核酸檢測試劑注冊申請和變更注冊申請的情形。本指導原則針對寨卡病毒核酸檢測試劑注冊申報資料中的部分內容進(jìn)行撰寫(xiě)，其他未盡事宜應當符合《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告》等相關(guān)法規要求，同時(shí)建議參考《定性檢測試劑分析性能評估注冊審查指導原則》等適用的技術(shù)文件要求。

二、注冊審查要點(diǎn)

（一）監管信息

1.產(chǎn)品名稱(chēng)及分類(lèi)編碼

產(chǎn)品名稱(chēng)應符合《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》及相關(guān)法規的要求，如寨卡病毒核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）。根據《體外診斷試劑分類(lèi)規則》，該產(chǎn)品按照第三類(lèi)體外診斷試劑管理，分類(lèi)編碼為6840。

2.其他信息還包括產(chǎn)品列表、關(guān)聯(lián)文件、申報前與監管機構的聯(lián)系情況和溝通記錄以及符合性聲明等文件。

（二）綜述資料

綜述資料主要包括概述、產(chǎn)品描述、預期用途、申報產(chǎn)品上市歷史及其他需說(shuō)明的內容。應詳細說(shuō)明產(chǎn)品所采用的技術(shù)原理及檢測流程。提供不同適用機型的檢測通量，即一次檢測最多可檢測的樣本數。提供核酸提?。ㄊ止ず妥詣?dòng)提取方式應分別明確）和PCR擴增的時(shí)間，以及檢測全過(guò)程所需的時(shí)間。不同檢測流程，分別提供最少和最多檢測樣本量下的檢測時(shí)間。與已上市同類(lèi)產(chǎn)品進(jìn)行比較，比較內容包括樣本類(lèi)型，檢測原理，檢測靶基因，組成成分，內標，質(zhì)控品，判讀規則，分析性能和臨床性能等。

預期用途中明確產(chǎn)品檢測的靶基因，需選擇保守性和特異性相對較高的基因，同時(shí)還應考慮基因的擴增效率。檢測基因的選擇應提供相關(guān)指南或文獻，并分析所檢測基因的靈敏度和特異性是否符合臨床需求。

（三）非臨床資料

1.分析性能研究

注冊申請人應采用在符合質(zhì)量管理體系的環(huán)境下生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行所有分析性能研究，提交具體研究方法、試驗方案、試驗數據、統計分析等詳細資料。

分析性能評估所用樣本的基本信息均需明確，例如樣本來(lái)源、樣本類(lèi)型、采集和處理方式、稀釋方式、定值過(guò)程及數據等。研究中采用的寨卡病毒陽(yáng)性樣本，應采用科學(xué)合理的方法確定其陰陽(yáng)性和濃度水平，提交具體的試驗資料。建議采用國際標準品建立校準曲線(xiàn)的方法確定研究樣本的濃度。分析性能評估用樣本一般應為真實(shí)樣本，如涉及稀釋后檢測，應采用與適用樣本類(lèi)型一致的陰性基質(zhì)。不可采用質(zhì)粒、假病毒或體外轉錄RNA等，進(jìn)行分析性能評估。對于各項性能中采用的樣本，在下述各項性能研究資料中分別提供樣本信息列表。檢出限和包容性研究中所用樣本應相互獨立。

1.1樣本穩定性

考慮到病毒RNA極易被降解的特性，應對樣本穩定性進(jìn)行詳細研究，包括采集后未經(jīng)處理的樣本，滅活處理后的樣本，研究?jì)热莅ɡ洳乇４鏁r(shí)間，冷凍保存時(shí)間，凍融次數等。

建議對每種樣本類(lèi)型均進(jìn)行穩定性研究。

如核酸提取液可不立即進(jìn)行檢測，還需對經(jīng)提取后的核酸產(chǎn)物的保存條件和穩定性進(jìn)行研究。

1.2企業(yè)參考品驗證

根據主要原材料研究資料中的企業(yè)參考品設置情況，采用三批產(chǎn)品對企業(yè)參考品進(jìn)行檢驗并提供詳細的試驗數據。

1.3準確度

可采用方法學(xué)比對或參考品（盤(pán)）檢測的方法進(jìn)行研究。

1.4精密度

應對精密度指標，如標準差或變異系數等的評價(jià)標準做出合理要求。應考慮運行、時(shí)間、操作者、儀器、試劑批次和地點(diǎn)等影響精密度的條件，設計合理的精密度試驗方案進(jìn)行評價(jià)。精密度評價(jià)試驗應包含核酸提取步驟。設定合理的精密度評價(jià)周期，例如為期至少20天的檢測。對檢測數據進(jìn)行統計分析，獲得重復性、實(shí)驗室內精密度、實(shí)驗室間精密度、批間精密度等結果。

采用臨床樣本或病毒培養物進(jìn)行精密度評價(jià)，應至少包含3個(gè)水平：陰性樣本、臨界陽(yáng)性樣本、中/強陽(yáng)性樣本，并根據產(chǎn)品特性設定適當的精密度要求，例如：

陰性樣本：不含待測物，陰性檢出率應為100%（n≥20）。

臨界陽(yáng)性樣本：待測物濃度略高于試劑盒的檢出限，陽(yáng)性檢出率應≥95%（n≥20）。

中/強陽(yáng)性樣本：待測物濃度呈中度到強陽(yáng)性，陽(yáng)性檢出率為100%且Ct值的CV≤5%（n≥20）。

1.5包容性

1.5.1采用生物信息學(xué)方法對產(chǎn)品檢測的包容性進(jìn)行研究，研究應覆蓋已公布的寨卡病毒核酸序列。

1.5.2驗證具有時(shí)間和區域特征性的不同來(lái)源的陽(yáng)性樣本，應包括檢出限和重復性的驗證。樣本應覆蓋已知寨卡病毒的主要型別，包含對亞洲型、非洲型和其他重點(diǎn)型別各不少于3個(gè)不同來(lái)源的陽(yáng)性樣本（臨床樣本或病毒培養物）的研究。

1.6檢出限

1.6.1檢出限的確定

建議采用亞洲型和非洲型的流行株樣本系列稀釋于與適用樣本一致的基質(zhì)中，進(jìn)行檢出限的確定。每個(gè)濃度梯度重復檢測，記錄不同濃度檢出的結果，采用適當的模型（如Probit分析）和分析方法，將具有95%陽(yáng)性檢出率的最低濃度水平作為確定的檢出限。申請人可采用半數組織感染量測定法（TCID50）的方法進(jìn)行毒株濃度確認，以TCID50/mL作為毒株濃度的表示方式；也可采用空斑形成單位（PFU）的方式進(jìn)行毒株濃度的確認，以PFU/mL作為毒株濃度的表示方式。除此之外，申請人還應采用數字PCR、標準曲線(xiàn)等方法進(jìn)行毒株核酸濃度的確認，以copies/mL作為毒株濃度的表示方式；采用國際標準品建立校準曲線(xiàn)的方法確定研究樣本的國際單位濃度。

1.6.2檢出限的驗證

選擇另外3例不同來(lái)源的寨卡病毒樣本在檢出限濃度水平進(jìn)行驗證，應達到95%陽(yáng)性檢出率。

1.7分析特異性

1.7.1交叉反應

需驗證相關(guān)病原體和多例人類(lèi)基因組DNA（表1）的交叉反應。建議在病毒和細菌感染的醫學(xué)相關(guān)水平進(jìn)行交叉反應的驗證。通常，細菌感染的濃度水平為106CFU/mL或更高，病毒為105PFU/mL或更高，提供所有用于交叉反應驗證的病原體樣本的來(lái)源、陰陽(yáng)性、種屬/型別和濃度確認等試驗資料。

對于某些難以培養或因為生物安全性無(wú)法培養的病原體，可采用病原體核酸樣本進(jìn)行交叉驗證。應提供用于交叉反應驗證的病原體核酸的來(lái)源、組成和濃度等信息，濃度可采用copies/mL單位表示。

注：*標注為可采用生物信息學(xué)分析的方法進(jìn)行研究的病原體。

1.7.2競爭性干擾

申請人應充分考慮臨床上容易與寨卡病毒合并感染的病原體，如登革病毒等，在高濃度的情況下對低濃度（例如檢出限濃度）寨卡病毒核酸檢測的影響，進(jìn)行競爭性干擾研究。

1.7.3干擾試驗

應根據所采集樣本類(lèi)型，針對可能存在的內源/外源物質(zhì)干擾情況進(jìn)行驗證。建議申請人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度（“最差條件”）條件下進(jìn)行試驗，檢測包含臨界陽(yáng)性水平在內的寨卡病毒樣本。對結果進(jìn)行合理的統計分析，對比添加干擾物質(zhì)前后的Ct值差異。檢測的潛在干擾物包括樣本中的原有物質(zhì)及在樣本采集和處理期間引入的物質(zhì)。

1.8核酸（RNA）提取/純化性能

在進(jìn)行核酸檢測之前，建議有核酸（RNA）提取/純化步驟。該步驟的目的除最大量分離出目的RNA外，還應有相應的純化作用，盡可能去除PCR抑制物。對配合使用的所有核酸提取試劑進(jìn)行提取核酸純度、濃度、提取效率的研究，并與質(zhì)量較好的核酸提取試劑進(jìn)行平行比對。若產(chǎn)品適用兩種或以上核酸提取試劑，則每一種核酸提取試劑均需配合檢測試劑至少進(jìn)行抗干擾、再現性和檢出限的驗證，如果配套核酸提取試劑提取原理存在差異，還需額外進(jìn)行檢出限的建立。

1.9反應體系

1.9.1樣本采集和處理

1.9.1.1樣本采集方式的選擇

1.9.1.2樣本采集時(shí)間點(diǎn)的選擇：是否受病程、臨床癥狀、用藥情況等因素的影響。

1.9.1.3樣本處理方式的選擇：研究產(chǎn)品適用的滅活方式，包括熱滅活和化學(xué)滅活，化學(xué)滅活部分應對常見(jiàn)的消毒劑的適用性進(jìn)行研究。研究樣本前處理方式，包括對不同樣本類(lèi)型的離心條件的確定研究等。

1.9.2核酸提取和反應體系

研究確定最佳核酸提取和反應體系，包括核酸提取用的樣本體積、洗脫體積和PCR加樣體積、各種酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽(yáng)離子濃度及反應各階段溫度、時(shí)間、循環(huán)數等。建議在保證核酸提取質(zhì)量的情況下盡量擴大總反應體系和加樣量，以提高檢測靈敏度。

提交不同適用機型基線(xiàn)和閾值循環(huán)數的確定資料。

不同適用機型的反應條件如果有差異應分別詳述，并提交驗證資料。

2.穩定性研究

申報試劑的穩定性主要包括實(shí)時(shí)穩定性（有效期）、開(kāi)瓶穩定性、運輸穩定性、機載穩定性（如適用）及凍融次數限制等研究，申請人可根據實(shí)際需要選擇合理的穩定性研究方案。穩定性研究資料應包括具體的實(shí)施方案、詳細的研究數據以及統計分析結論。對于實(shí)時(shí)穩定性研究，應提供至少三批產(chǎn)品在實(shí)際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。對于開(kāi)瓶穩定性研究應模擬真實(shí)使用情形，包括開(kāi)瓶穩定性的開(kāi)瓶頻次和開(kāi)瓶時(shí)間等。

3.陽(yáng)性判斷值研究

陽(yáng)性判斷值一般為申報產(chǎn)品檢測病毒核酸陽(yáng)性的Ct值。陽(yáng)性判斷值研究用樣本來(lái)源應具有多樣性和代表性，考慮不同時(shí)間、地域、不同的感染階段和生理狀態(tài)等因素，盡量納入較多弱陽(yáng)性的樣本，陰性樣本應包含易交叉病原體高濃度樣本。在條件允許的情況下，建議覆蓋目前的流行株進(jìn)行陽(yáng)性判斷值研究。如判定值存在灰區，應提供灰區的確認資料。

如果產(chǎn)品適用不同樣本類(lèi)型，需要對各樣本類(lèi)型進(jìn)行陽(yáng)性判斷值的驗證。

提交陽(yáng)性判斷值研究所用樣本的背景信息列表，至少包括性別、年齡、臨床診斷信息、樣本來(lái)源機構、檢測結果等信息。

提供內標檢測結果范圍的確定方法和研究資料。

4. 其他資料

4.1主要原材料研究資料

該類(lèi)產(chǎn)品的主要原材料包括引物、探針、酶、dNTP、核酸分離/純化組分（如有）、質(zhì)控品、參考品等。應提供主要原材料的選擇與來(lái)源、制備過(guò)程、質(zhì)量控制標準等相關(guān)研究資料、質(zhì)控品的定值試驗資料等。如主要原材料為企業(yè)自制，應提供其詳細制備過(guò)程；如主要原材料源于外購，應提供資料包括：選擇該原材料的依據及對比篩選試驗資料、供貨方提供的質(zhì)量標準、出廠(chǎng)檢驗報告，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗資料。供應商應固定，不得隨意更換。

4.1.1引物和探針：應詳述引物和探針的設計原則，提供引物、探針核酸序列、靶序列的基因位點(diǎn)及兩者的對應情況。建議每種病毒設計兩套或多套引物、探針以供篩選，通過(guò)序列比對和功能性試驗等方式，對病毒進(jìn)行包容性和特異性（如交叉反應）的評價(jià)，其中序列比對包括與已公布寨卡病毒序列的比對，及與易產(chǎn)生交叉反應的其他病原體的序列比對；功能性試驗包括對不同來(lái)源、不同滴度的寨卡病毒核酸陽(yáng)性樣本，和不同的近緣病原體的檢測。通過(guò)篩選確定最佳的引物和探針組合。引物、探針的質(zhì)量標準應至少包括序列準確性、純度、濃度及功能性試驗等。

4.1.2脫氧三磷酸核苷（dNTP）：包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP，應提供對其純度、濃度、功能性等的詳細驗證資料。

4.1.3酶：需要的酶主要包括DNA聚合酶、逆轉錄酶、尿嘧啶DNA糖基化酶等，應分別對酶活性、功能性等進(jìn)行評價(jià)和驗證。

4.1.4質(zhì)控品

試劑盒一般包含陰性質(zhì)控品和陽(yáng)性質(zhì)控品。陽(yáng)性質(zhì)控品應包含試劑盒檢測的靶序列，可采用假病毒制備。質(zhì)控品需參與樣本處理、核酸的平行提取和檢測的全過(guò)程，以對整個(gè)提取和PCR擴增過(guò)程、試劑/設備、交叉污染等環(huán)節進(jìn)行合理質(zhì)量控制。提交試劑盒質(zhì)控品有關(guān)原料選擇、制備、定值過(guò)程、濃度范圍等試驗資料，對質(zhì)控品的檢測結果Ct值范圍做出明確的要求。

4.1.5內標

內標，又稱(chēng)內對照，可對管內抑制導致的假陰性結果進(jìn)行質(zhì)量控制，應與靶核酸一同提取及擴增。申請人需對內標的引物、探針設計和相關(guān)反應體系的濃度做精確驗證，既要保證內標熒光通道呈明顯的陽(yáng)性曲線(xiàn)又要盡量降低對靶基因檢測造成的抑制。明確內標的檢測結果Ct值范圍。建議科學(xué)設置內標，對待測樣本的取樣質(zhì)量、試劑的反應體系進(jìn)行監控。

4.1.6企業(yè)參考品

該類(lèi)產(chǎn)品的企業(yè)參考品一般包括陽(yáng)性參考品、陰性參考品、檢出限參考品和重復性參考品。應根據產(chǎn)品性能驗證的實(shí)際需要設置企業(yè)參考品。

應提交企業(yè)參考品的原料來(lái)源、選擇、制備、陰陽(yáng)性及濃度確認方法或試劑等相關(guān)驗證資料。企業(yè)參考品應采用臨床樣本，或者使用病毒培養物加入陰性基質(zhì)。企業(yè)參考品的設置建議如下：

陽(yáng)性參考品：應著(zhù)重考慮不同來(lái)源的病毒樣本和滴度要求，應至少選取不同來(lái)源的5個(gè)病毒樣本。

陰性參考品：主要涉及對交叉反應的驗證情況，建議包括登革病毒（DENV-1～DENV-4）、西尼羅病毒、黃熱病毒、乙型腦炎病毒、森林腦炎病毒、基孔肯雅病毒、新型布尼亞病毒、漢坦病毒、漢城病毒、麻疹病毒、風(fēng)疹病毒、丙型肝炎病毒 、EB病毒、人巨細胞病毒、腸道病毒71型、柯薩奇病毒A16型、?？刹《?、細小病毒B19；立克次體、鉤端螺旋體 、瘧原蟲(chóng)；傷寒桿菌、金黃色葡萄球菌等。

檢出限參考品：可采用95%陽(yáng)性檢出水平或略高于檢出限的水平，如100%陽(yáng)性檢出水平。

重復性參考品：建議包括高、低兩個(gè)濃度的樣本，其中一個(gè)濃度應為檢出限附近的濃度。

4.2生產(chǎn)工藝研究資料

介紹產(chǎn)品主要生產(chǎn)工藝，可用流程圖結合文字的方式表述。提交主要生產(chǎn)工藝的確定及優(yōu)化研究資料。

（四）臨床評價(jià)資料

該類(lèi)試劑應通過(guò)臨床試驗路徑進(jìn)行臨床評價(jià)。臨床試驗應符合《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》《醫療器械臨床試驗質(zhì)量管理規范》和《體外診斷試劑臨床試驗技術(shù)指導原則》的要求，如相關(guān)法規、文件有更新，臨床試驗應符合更新后的要求。下面僅說(shuō)明該類(lèi)產(chǎn)品臨床試驗中應關(guān)注的重點(diǎn)問(wèn)題。

1.臨床試驗機構

應選擇具備相應條件且按照規定備案的醫療器械臨床試驗機構開(kāi)展臨床試驗。寨卡病毒病屬于區域性傳染性疾病，建議申請人在相關(guān)流行病學(xué)多發(fā)區域開(kāi)展臨床試驗。臨床試驗機構數量應不少于3家，且具有分子生物學(xué)方法檢測的優(yōu)勢，試驗操作人員應有足夠的時(shí)間熟悉檢測系統的各環(huán)節（儀器、試劑、質(zhì)控及操作程序等），熟悉試驗方案。在整個(gè)試驗中，試驗體外診斷試劑和對比方法均應處于有效的質(zhì)量控制下，最大限度保證試驗數據的準確性及可重復性。

2.臨床試驗方法

2.1與對比方法的比較研究

2.1.1申請人可采用試驗體外診斷試劑與核酸序列測定（Sanger測序）方法進(jìn)行對比試驗，評價(jià)兩種檢測方法的一致性。同時(shí)還應進(jìn)行部分與寨卡病毒分離培養鑒定的對比試驗。以上兩方面評價(jià)結果結合起來(lái)共同論證試驗體外診斷試劑的臨床性能。

臨床試驗資料中應對測序方法進(jìn)行詳細的介紹，并提交性能驗證數據，證明測序方法與試驗體外診斷試劑的可比性。如測序試驗委托其他機構完成，還應提交由臨床試驗機構委托第三方機構/實(shí)驗室開(kāi)展相關(guān)試驗的測序服務(wù)合同/協(xié)議，提交相關(guān)機構資質(zhì)證明文件和選擇依據。

2.1.2 如有已上市同類(lèi)產(chǎn)品，臨床試驗亦可選擇已上市的同類(lèi)產(chǎn)品作為對比試劑，對比試劑的選擇應考慮在預期用途、樣本類(lèi)型、產(chǎn)品性能等方面應與試驗體外診斷試劑具有良好的可比性。

2.2 與臨床參考標準的比較研究

在上述比較研究的基礎上，申請人還應采用試驗體外診斷試劑與寨卡病毒病診斷的臨床參考標準進(jìn)行比較研究，評價(jià)試驗體外診斷試劑的臨床性能。寨卡病毒病診斷的臨床參考標準可參考國家衛健委發(fā)布的現行有效的寨卡病毒病診療方案推薦的確診依據。

3.臨床試驗受試者的選擇

臨床試驗的受試人群應來(lái)自產(chǎn)品的預期適用人群，該產(chǎn)品的適用人群為寨卡病毒感染的疑似病例，申請人在進(jìn)行臨床試驗時(shí)應依據國家衛健委發(fā)布的現行有效的寨卡病毒病診療方案中對“疑似病例”的定義確定受試者入組標準。同時(shí)還應入組部分需要進(jìn)行鑒別診斷的其他病原體感染病例，如登革熱等，對產(chǎn)品臨床特異度進(jìn)行充分評價(jià)。根據產(chǎn)品預期適用人群和寨卡病毒病發(fā)病特征，臨床試驗受試者中應包含一定數量的孕婦和嬰幼兒受試者。此外臨床試驗應納入部分弱陽(yáng)性樣本。

4.臨床試驗樣本類(lèi)型

寨卡病毒核酸檢測可能涉及的樣本類(lèi)型包括血清、血漿、唾液、精液和尿液等。臨床樣本的采集建議按照國家衛健委發(fā)布的相關(guān)實(shí)驗室檢測技術(shù)方案執行。

如申報產(chǎn)品適用于不同的樣本類(lèi)型，且經(jīng)分析和驗證不同樣本類(lèi)型之間幾乎不存在差異，例血清和血漿樣本，則臨床試驗中不同樣本類(lèi)型可進(jìn)行匯總統計。如不同樣本類(lèi)型在樣本基質(zhì)、干擾因素、被測物濃度水平等方面存在差異，例如血清/血漿與尿液、精液和唾液，則應針對不同樣本類(lèi)型分別進(jìn)行臨床性能評價(jià)，包括分別進(jìn)行樣本量的估算等。

5.臨床試驗樣本量

臨床試驗陽(yáng)性樣本和陰性樣本數量應分別滿(mǎn)足統計學(xué)要求。針對與Sanger測序法或同類(lèi)已上市產(chǎn)品的對比試驗，可采用目標值法公式分別估算最低陽(yáng)性和陰性樣本例數。

樣本量估算公式如下，

公式中，n為樣本量；Z1-α、Z1-β為顯著(zhù)性水平和把握度的標準正態(tài)分布的分數位，P0為評價(jià)指標的臨床可接受標準，PT為試驗體外診斷試劑評價(jià)指標預期值。

其中陽(yáng)性符合率和陰性符合率的臨床可接受標準（P0）建議不低于90%。臨床試驗結果中，相關(guān)評價(jià)指標的95%置信區間下限應不低于預設的臨床可接受標準。當評價(jià)指標P接近100%時(shí)，上述樣本量估算方法可能不適用，應考慮選擇更加適宜的方法進(jìn)行樣本量估算和統計學(xué)分析，如精確概率法等。

與病毒分離培養鑒定的對比試驗亦應入組一定數量的培養陽(yáng)性及培養陰性病例，可采用抽樣精度的公式進(jìn)行樣本量估算。

與臨床參考標準對比的比較研究，建議參考上述與對比方法對比的樣本量估算方法，設定合理的臨床可接受標準。

6.臨床試驗結果的統計分析

臨床試驗結果一般以四格表的形式進(jìn)行總結，并據此計算試驗體外診斷試劑的靈敏度和特異度，或與對比方法的陽(yáng)性/陰性符合率及其95%置信區間。

臨床試驗報告中應對入組受試者的基本情況進(jìn)行分析，包括受試者年齡、性別的分布情況，以及臨床診斷背景等，確認入組樣本具有較好的代表性。臨床試驗中如涉及不同樣本類(lèi)型，應針對每種樣本類(lèi)型分別進(jìn)行統計分析（血清、血漿除外）。

臨床試驗中所有不一致結果均應結合患者的流行病學(xué)背景、臨床癥狀、臨床診斷以及疾病治療、轉歸等信息進(jìn)行充分的分析。臨床試驗結果應能夠證明產(chǎn)品臨床性能滿(mǎn)足臨床要求。

7.境外臨床試驗數據的認可

境外臨床試驗數據應符合《接受醫療器械境外臨床試驗數據技術(shù)指導原則》和《使用體外診斷試劑境外臨床試驗數據的注冊審查指導原則》的相關(guān)要求。提交完整的臨床試驗方案、報告和倫理審查意見(jiàn)，以及該數據適用于中國患者人群的論證資料、境內外臨床試驗質(zhì)量管理差異的對比資料和臨床試驗質(zhì)量管理差異對于臨床試驗結果影響的論證資料。

注冊申請人應根據上述臨床試驗技術(shù)審評要求，論證境外臨床試驗數據的充分性。

8.臨床試驗資料要求

申請人應按照《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》、《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告》等法規文件要求提交各機構倫理審查意見(jiàn)、臨床試驗方案、臨床試驗小結、臨床試驗報告以及臨床試驗數據庫。

（五）產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)和標簽樣稿

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)格式應滿(mǎn)足《體外診斷試劑說(shuō)明書(shū)編寫(xiě)指導原則》的要求。產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)中技術(shù)內容應與注冊申報資料中的相關(guān)研究結果保持一致，如某些內容引用自參考文獻，應以規范格式進(jìn)行標注，并單獨列明文獻的相關(guān)信息。寨卡病毒核酸檢測試劑說(shuō)明書(shū)編寫(xiě)應重點(diǎn)關(guān)注以下內容。

1．【預期用途】

1.1試劑盒用于體外定性檢測寨卡病毒病疑似病例、其他需要進(jìn)行寨卡病毒感染診斷或鑒別診斷者的XXX樣本（具體描述樣本類(lèi)型）中的寨卡病毒RNA。

1.2有關(guān)“疑似病例”等人群的定義參照現行有效的《寨卡病毒病診療方案》及《寨卡病毒病防控方案》等文件執行。

1.3簡(jiǎn)單介紹寨卡病毒病病原學(xué)特征、流行病學(xué)特征以及臨床表現和現有診斷方法等。

1.4強調本試劑盒檢測結果僅供臨床參考，不得作為臨床診斷的唯一標準。建議結合患者臨床表現和其他實(shí)驗室檢測對病情進(jìn)行綜合分析。

2.【檢驗原理】

簡(jiǎn)述產(chǎn)品的核酸提取和RT-PCR原理。明確內標基因名稱(chēng)及其作用。如采用了防污染措施，進(jìn)行簡(jiǎn)要描述。

3.【主要組成成分】

明確試劑盒中各組分及具體成分。明確需要但未提供的材料，例如核酸提取試劑等的產(chǎn)品名稱(chēng)，生產(chǎn)廠(chǎng)家，貨號及注冊證號、備案號等信息。

4.【樣本要求】

4.1樣本的收集：分別明確推薦的不同樣本類(lèi)型樣本的采集時(shí)間（如發(fā)病后7天內）。需詳細描述樣本采集和處理方式，包括采樣步驟，滅活方式，采樣體積，離心要求等。樣本的采集及處理方式若有通用的技術(shù)規范或指南，則應遵循，并在此處引用。血漿樣本應列明適用的抗凝劑類(lèi)型。

4.2樣本的運送與保存：描述樣本及核酸提取液的保存穩定性、運送條件等。如聲稱(chēng)樣本可以?xún)龃?，還應明確凍融次數的限制。

5.【檢驗方法】

明確核酸提取用的樣本體積、洗脫體積和PCR加樣體積，陰、陽(yáng)性質(zhì)控品與待測樣本同步進(jìn)行核酸提取操作。明確各適用機型的反應參數設置。明確質(zhì)控品和內標的檢測結果Ct值范圍，作為試驗有效性的標準。

6.【檢驗結果的解釋】

通過(guò)擴增曲線(xiàn)和Ct值進(jìn)行結果陰陽(yáng)性的判斷，列明結果陰性、陽(yáng)性、復測、無(wú)效等所有情形。

7.【檢驗方法的局限性】

7.1本試劑盒的檢測結果僅供臨床參考，對患者的臨床診治應結合其癥狀/體征、病史、其他實(shí)驗室檢查及治療反應等情況綜合考慮。

7.2有關(guān)假陽(yáng)性結果的可能性分析

7.2.1如果樣本在運輸、處理過(guò)程中發(fā)生交叉污染，則可能導致假陽(yáng)性結果；

7.2.2試驗環(huán)境有PCR產(chǎn)物等氣溶膠污染，則可能導致假陽(yáng)性結果；

7.2.3試驗過(guò)程中使用的耗材、設備等受污染，則可能導致假陽(yáng)性結果。

7.3有關(guān)假陰性結果的可能性分析

7.3.1不合理的樣本采集、轉運、儲存及處理、樣本中病原體含量過(guò)低均有可能導致假陰性結果；

7.3.2該病原體待測靶序列的變異或其他原因導致的序列改變可能會(huì )導致假陰性結果；

7.3.3 未經(jīng)驗證的其他干擾或PCR抑制因子等可能會(huì )導致假陰性結果。

8.【產(chǎn)品性能指標】

簡(jiǎn)述以下性能指標：

8.1國家標準品和企業(yè)參考品的符合率。

8.2檢出限：簡(jiǎn)要介紹評價(jià)方法、所用樣本情況以及評價(jià)結果。

8.3對包容性的研究情況進(jìn)行總結。

8.4對精密度的研究情況進(jìn)行總結。

8.5分析特異性

8.5.1交叉反應：詳述交叉反應驗證的病原體種類(lèi)，及有/無(wú)交叉反應的濃度水平。

8.5.2干擾試驗：說(shuō)明驗證的干擾物質(zhì)種類(lèi)及有/無(wú)干擾反應的濃度水平。

8.6臨床試驗：簡(jiǎn)要介紹試驗方法、受試者及樣本、試驗結果和結論等。

9.【注意事項】

9.1臨床實(shí)驗室應嚴格按照《醫療機構臨床基因擴增檢驗實(shí)驗室管理辦法》等有關(guān)分子生物學(xué)實(shí)驗室要求、臨床基因擴增實(shí)驗室的管理規范。

9.2 試驗操作人員應接受過(guò)基因擴增或分子生物學(xué)方法檢測的專(zhuān)業(yè)培訓，具備相關(guān)的試驗操作資格，實(shí)驗室應符合《病原微生物實(shí)驗室生物安全管理條例》及其他涉及到傳染性病原微生物的管理規定中的相關(guān)要求。

9.2試劑保存運輸及使用過(guò)程中多種因素可能導致性能變化，如保存運輸不當、樣本采集、樣本處理及檢測過(guò)程操作不規范等，請嚴格按照說(shuō)明書(shū)操作。

9.3避免實(shí)驗室污染的措施

三、參考文獻

[1]國家市場(chǎng)監督管理總局.體外診斷試劑注冊與備案管理辦法:國家市場(chǎng)監督管理總局令第48號[Z]

[2]國家藥品監督管理局.關(guān)于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告:國家藥品監督管理局公告2021年第122號[Z]

[3]國家藥品監督管理局 國家衛生健康委.醫療器械臨床試驗質(zhì)量管理規范:國家藥品監督管理局 國家衛生健康委公告2022年第28號[Z]

[4]國家藥品監督管理局.體外診斷試劑臨床試驗技術(shù)指導原則:國家藥品監督管理局公告2021年第72號[Z]

[5]國家食品藥品監督管理總局.接受醫療器械境外臨床試驗數據技術(shù)指導原則:國家食品藥品監督管理總局公告2018年第13號[Z]

[6]國家藥品監督管理局.使用體外診斷試劑境外臨床試驗數據的注冊審查指導原則:國家藥品監督管理局公告2021年第95號[Z]

[7]國家食品藥品監督管理總局.體外診斷試劑說(shuō)明書(shū)編寫(xiě)指導原則:國家食品藥品監督管理總局公告2014年第17號[Z]

[8]中華人民共和國衛生健康委員會(huì ).寨卡病毒病診療方案（2016年第2版）[Z]2016-03-17

[9]中華人民共和國衛生健康委員會(huì ).寨卡病毒病防控方案（第二版）[Z]2016-03-28

[10]衛生部.醫療機構臨床基因擴增檢驗實(shí)驗室管理辦法[Z]2010-12-10

[11]中華人民共和國生態(tài)環(huán)境部.病原微生物實(shí)驗室生物安全管理條例:中國人民共和國國務(wù)院令第424號公布 2018年第二次修訂[Z]