曲霉核酸檢測試劑注冊審查指導原則（2024年第1號）

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曲霉核酸檢測試劑注冊審查指導原則

本指導原則旨在指導注冊申請人對曲霉核酸檢測試劑注冊申報資料的準備及撰寫(xiě)，同時(shí)也為技術(shù)審評部門(mén)提供參考。

本指導原則是對曲霉核酸檢測試劑的一般要求，申請人應依據產(chǎn)品的具體特性確定其中內容是否適用。若不適用，需具體闡述理由及相應的科學(xué)依據，并依據產(chǎn)品的具體特性對注冊申報資料的內容進(jìn)行充實(shí)和細化。

本指導原則是供注冊申請人和技術(shù)審評人員使用的指導性文件，但不包括審評審批所涉及的行政事項，亦不作為法規強制執行，應在遵循相關(guān)法規的前提下使用本指導原則。如果有能夠滿(mǎn)足相關(guān)法規要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細的研究資料和驗證資料。

本指導原則是在現行法規和標準體系以及當前認知水平下制定，隨著(zhù)法規和標準的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，相關(guān)內容也將適時(shí)進(jìn)行調整。

真菌的生物分類(lèi)包括門(mén)、綱、目、科、屬等，本指導原則對真菌的分類(lèi)描述如無(wú)特殊說(shuō)明均為“種”，如指“目”或“屬”等均已在原文中明確。

一、適用范圍

本指導原則適用于采用實(shí)時(shí)熒光PCR法，對肺泡灌洗液、痰液、組織樣本等中的曲霉核酸進(jìn)行體外定性檢測的試劑，包含曲霉屬（Aspergillus）通用型核酸檢測試劑和曲霉屬中一個(gè)或多個(gè)菌種的檢測試劑。檢測結果臨床上用于肺曲霉病的輔助診斷。

對于采用其他方法學(xué)的曲霉核酸檢測試劑，可能部分要求不完全適用或本文所述內容不夠全面，申請人應參照本指導原則，根據產(chǎn)品特性對適用部分進(jìn)行評價(jià)，并補充其他的評價(jià)資料。

本指導原則適用于曲霉核酸檢測試劑注冊申請和變更注冊申請的情形。本指導原則針對曲霉核酸檢測試劑注冊申報資料中的部分內容進(jìn)行撰寫(xiě)，其他未盡事宜應當符合《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告》等相關(guān)法規的要求，同時(shí)建議參考《定性檢測試劑分析性能評估注冊審查指導原則》等適用的技術(shù)文件要求。

二、注冊審查要點(diǎn)

（一）監管信息

1.產(chǎn)品名稱(chēng)及分類(lèi)編碼

產(chǎn)品名稱(chēng)應體現檢測目標病原體，如曲霉核酸檢測試劑盒（實(shí)時(shí)熒光PCR法）、煙曲霉核酸檢測試劑盒（實(shí)時(shí)熒光PCR法）等。該產(chǎn)品按照第三類(lèi)體外診斷試劑管理，分類(lèi)編碼為6840。

2.其他信息還包括產(chǎn)品列表、關(guān)聯(lián)文件、申報前與監管機構的聯(lián)系情況和溝通記錄以及符合性聲明等文件。

（二）綜述資料

綜述資料主要包括概述、產(chǎn)品描述、預期用途、申報產(chǎn)品上市歷史及其他需說(shuō)明的內容。應詳細說(shuō)明產(chǎn)品所采用的技術(shù)原理及檢測流程。明確產(chǎn)品檢測靶基因，提供引物和探針的設計依據。提供核酸提?。ㄊ止ず妥詣?dòng)提取方式應分別明確）和PCR擴增的時(shí)間，提供不同適用機型的檢測通量（如適用）。與已上市同類(lèi)產(chǎn)品或前代產(chǎn)品進(jìn)行比較，比較內容包括樣本類(lèi)型，檢測原理，檢測靶基因，組成成分，內標，質(zhì)控品，判讀規則，分析性能和臨床性能等。提供樣本類(lèi)型選擇的依據。提供產(chǎn)品預期用途和臨床適應證，明確適用人群的情況。

（三）非臨床資料

1.分析性能研究

分析性能評估所用樣本的基本信息均需明確，例如樣本來(lái)源、樣本類(lèi)型、采集和處理方式、稀釋方式、定值過(guò)程及數據等。研究中采用的曲霉陽(yáng)性樣本，應采用科學(xué)合理的方法確定其陰陽(yáng)性和濃度水平，提交具體的試驗資料，并明確培養和鑒定結果。分析性能評估用樣本均應采用真實(shí)樣本（臨床樣本或培養菌株），如涉及稀釋后檢測，應采用與適用樣本類(lèi)型一致的陰性基質(zhì)。也可采用人工構建樣本（如質(zhì)粒）進(jìn)行研究，此部分研究可作為額外研究資料提交注冊。對于各項性能中采用的樣本，在下述各項性能研究資料中分別提供樣本信息列表。檢出限和包容性研究中所用樣本應相互獨立。

1.1樣本穩定性

應對樣本穩定性進(jìn)行詳細研究，包括采集后未經(jīng)處理的樣本，加入不同裂解液/消化液的樣本，滅活處理后的樣本（如適用），研究?jì)热莅ɡ洳乇４鏁r(shí)間，冷凍保存時(shí)間，凍融次數等。

如產(chǎn)品適用不同的樣本類(lèi)型，應對每種樣本類(lèi)型進(jìn)行穩定性研究。

如核酸提取液可不立即進(jìn)行檢測，還需對核酸提取液的保存條件和穩定性進(jìn)行研究。

1.2企業(yè)參考品驗證

根據主要原材料研究資料中的企業(yè)參考品設置情況，采用三批產(chǎn)品對企業(yè)參考品進(jìn)行檢驗并提供詳細的試驗數據。

1.3精密度

應對精密度指標，如標準差或變異系數等的評價(jià)標準做出合理要求。應考慮運行、時(shí)間、操作者、儀器、試劑批次和地點(diǎn)等影響精密度的條件，設計合理的精密度試驗方案進(jìn)行評價(jià)。精密度評價(jià)試驗應包含核酸提取步驟。設定合理的精密度評價(jià)周期，例如為期至少20天的檢測。對檢測數據進(jìn)行統計分析，獲得重復性、實(shí)驗室內精密度、實(shí)驗室間精密度、批間精密度等結果。

采用培養菌株進(jìn)行精密度評價(jià)，應至少包含3個(gè)水平：陰性樣本、臨界陽(yáng)性樣本、中/強陽(yáng)性樣本，采用孢子/mL作為菌株濃度的表示方式，并根據產(chǎn)品特性設定適當的精密度要求，例如：

陰性樣本：不含待測物，陰性檢出率應為100%（n≥20）。

臨界陽(yáng)性樣本：待測物濃度為試劑盒的檢出限濃度，陽(yáng)性檢出率應≥95%（n≥20）。

中/強陽(yáng)性樣本：待測物濃度呈中度到強陽(yáng)性，陽(yáng)性檢出率為100%且Ct值的CV≤5%（n≥20）。

1.4包容性

1.4.1采用生物信息學(xué)方法對產(chǎn)品檢測的包容性進(jìn)行研究，研究應覆蓋已公布的曲霉核酸序列。

1.4.2根據試劑盒檢測范圍選擇進(jìn)行包容性驗證的曲霉種，使用具有不同時(shí)間和區域特征性的不同來(lái)源的臨床樣本或培養菌株進(jìn)行驗證，每種菌種至少使用3例樣本，研究應包括檢出限和重復性的驗證。

對于曲霉屬通用型核酸檢測試劑，樣本應覆蓋已知曲霉屬中的主要致病菌種，至少包含煙曲霉（A.fumigatus）、黃曲霉（A.flavus）、黑曲霉（A.niger）、土曲霉（A.terreus）、構巢曲霉（A.nidulans）、米曲霉（A.oryzae）、聚多曲霉（A.sydowii）、雜色曲霉（A.versicolor）、亮白曲霉（A.candidus）、灰綠曲霉（A.glaucus）。

1.5檢出限

根據試劑盒檢測范圍選擇進(jìn)行檢出限驗證的曲霉種。如為曲霉屬通用型核酸檢測試劑，應至少對煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉、土曲霉、構巢曲霉分別進(jìn)行檢出限的確定和驗證。

1.5.1檢出限的確定

建議使用培養菌株系列稀釋于與適用樣本一致的陰性基質(zhì)中，進(jìn)行檢出限的確定。每個(gè)濃度梯度重復檢測，記錄不同濃度檢出的結果，采用適當的模型（如Probit分析）和分析方法，將具有95%陽(yáng)性檢出率的最低濃度水平作為確定的檢出限。建議申請人采用孢子/mL作為菌株濃度的表示方式，明確計數方法。除此之外，申請人還應確定LOD水平的CFU/mL濃度；采用數字PCR、標準曲線(xiàn)（通過(guò)標準物質(zhì)或構建質(zhì)粒繪制標準曲線(xiàn)）等方法進(jìn)行菌株核酸濃度的確認，以copies/mL作為菌株濃度的表示方式。應明確每份菌株的來(lái)源、濃度、制備方法等信息。

1.5.2檢出限的驗證

建議使用至少5份不同來(lái)源的最低檢測限水平的培養菌株，進(jìn)行至少20次的重復驗證，陽(yáng)性檢出率不低于95%。注冊申請人應能夠提供用于最低檢測限驗證的各個(gè)菌株的來(lái)源、制備方法及濃度等信息。

1.6分析特異性

1.6.1交叉反應

1.6.1.1交叉反應驗證的病原體種類(lèi)主要考慮以下幾方面：近緣菌、易引起相同或相似的臨床癥狀微生物、感染部位附近的定植菌等，研究樣本具體見(jiàn)表1。

1.6.1.2建議在病毒和細菌感染的醫學(xué)相關(guān)水平進(jìn)行交叉反應的驗證。通常，細菌感染的水平為106 CFU/mL或更高。

1.6.1.3申請人應提供所有用于交叉反應驗證的微生物的來(lái)源、種屬/型別和濃度確認等試驗資料。

1.6.2干擾試驗

應根據所采集樣本類(lèi)型，針對可能存在的內源/外源物質(zhì)干擾情況進(jìn)行驗證。建議申請人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度（“最差條件”）條件下進(jìn)行試驗，檢測包含臨界陽(yáng)性水平在內的曲霉樣本。對結果進(jìn)行合理的統計分析，對比添加干擾物質(zhì)前后的 Ct 值差異。檢測的潛在干擾物包括樣本中的原有物質(zhì)及在樣本采集和處理期間引入的物質(zhì)。用于干擾試驗研究的物質(zhì)具體見(jiàn)表2。

1.7核酸提取/純化性能

在進(jìn)行核酸檢測之前，建議有核酸提取/純化步驟。該步驟的目的為有效破環(huán)真菌細胞壁，分離出目的核酸，并應具有相應的純化作用，盡可能去除PCR抑制物。

研究確定核酸提取方法，闡述核酸提取原理，提交提取方案選擇研究資料。對配合使用的所有核酸提取試劑進(jìn)行提取核酸純度、濃度、提取效率的研究，并與質(zhì)量較好的核酸提取試劑進(jìn)行平行比對。若產(chǎn)品適用兩種或以上核酸提取試劑，則每一種核酸提取試劑均需配合檢測試劑至少進(jìn)行抗干擾、再現性和檢出限的驗證，如果配套核酸提取試劑提取原理存在差異，還需額外進(jìn)行檢出限的建立研究。

1.8反應體系

1.8.1樣本采集和處理

1.8.1.1樣本采集方式的選擇和樣本采集量的要求。

1.8.1.2樣本采集時(shí)間點(diǎn)的選擇：是否受病程、臨床癥狀、用藥情況等因素的影響。

1.8.1.3樣本處理方式的選擇：研究樣本適用的滅活方式，消化方式（如適用）、保存方式，包括樣本用量、保存溫度、時(shí)間等。

1.8.2核酸提取和反應體系

研究確定最佳核酸提取和反應體系，包括核酸提取用的樣本體積、洗脫體積和PCR加樣體積、各種酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽(yáng)離子濃度及反應各階段溫度、時(shí)間、循環(huán)數等。

提交不同適用機型基線(xiàn)和閾值循環(huán)數的確定資料。不同適用機型的反應條件如果有差異應分別詳述，并提交驗證資料。

2.穩定性研究

申報試劑的穩定性主要包括實(shí)時(shí)穩定性（有效期）、運輸穩定性、開(kāi)瓶穩定性及凍融次數限制等研究，申請人可根據實(shí)際需要選擇合理的穩定性研究方案。穩定性研究資料應包括具體的實(shí)施方案、詳細的研究數據以及統計分析結論。對于實(shí)時(shí)穩定性研究，應提供至少三批產(chǎn)品在實(shí)際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

3.陽(yáng)性判斷值研究

陽(yáng)性判斷值確定資料主要指對申報產(chǎn)品核酸檢測的Ct值，即結果判斷的臨界值進(jìn)行確認的資料。陽(yáng)性判斷值研究樣本來(lái)源應為預期人群，如臨床需要進(jìn)行肺曲霉病診斷或鑒別診斷的病例，并考慮不同年齡、地域等因素，盡可能考慮樣本來(lái)源的多樣性、代表性，盡量納入較多的弱陽(yáng)性樣本，以及一定數量的其他容易產(chǎn)生交叉反應的樣本。對于曲霉屬通用型核酸檢測試劑應納入不同曲霉種樣本進(jìn)行研究，并分別進(jìn)行統計分析，建議研究的菌種類(lèi)型與檢出限研究要求相同。建議申請人采用受試者工作特征（ROC）曲線(xiàn)的方式確定申報試劑用于結果判斷的臨界值，明確檢測結果判定依據，提交陽(yáng)性判斷值研究所用樣本的背景信息列表，至少包括性別、年齡、臨床診斷信息、樣本來(lái)源機構、檢測結果等信息。如判定值存在灰區，應提供灰區的確認資料。

另外，考慮建立陽(yáng)性判斷值時(shí)使用的臨床樣本對于目標人群的代表性，建議通過(guò)臨床評價(jià)進(jìn)一步驗證和確認陽(yáng)性判斷值的準確性。

如果產(chǎn)品適用不同樣本類(lèi)型，需要對各樣本類(lèi)型進(jìn)行陽(yáng)性判斷值的驗證。

提供內標檢測結果范圍的確定方法和研究資料。

4.其他資料

4.1主要原材料研究資料

該類(lèi)產(chǎn)品的主要原材料包括引物、探針、酶、dNTP、核酸分離/純化組分（如有）、質(zhì)控品、參考品等。應提供主要原材料的選擇與來(lái)源、制備過(guò)程、質(zhì)量控制標準等相關(guān)研究資料、質(zhì)控品的定值試驗資料等。如主要原材料為企業(yè)自制，應提供其詳細制備過(guò)程；如主要原材料源于外購，應提供資料包括：選擇該原材料的依據及對比篩選試驗資料、供貨方提供的質(zhì)量標準、出廠(chǎng)檢驗報告，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗資料。供應商應進(jìn)行必要的篩選或評價(jià)，供應商應固定，不得隨意更換。（如該原料為平臺通用原料，比如酶、dNTP等在其他項目上已篩選并平臺通用，可直接進(jìn)行驗證。）

4.1.1引物和探針：應詳述引物和探針的設計原則，提供引物、探針核酸序列、靶序列的基因位點(diǎn)及兩者的對應情況。建議設計兩套或多套引物、探針以供篩選，通過(guò)序列比對和功能性試驗等方式，對產(chǎn)品檢出限、包容性和特異性進(jìn)行評價(jià)。通過(guò)篩選確定最佳的引物和探針組合。引物、探針的質(zhì)量標準應至少包括序列準確性、純度、濃度及功能性試驗等。

4.1.2脫氧三磷酸核苷（dNTP）：應提供對其純度、濃度、功能性等的詳細驗證資料。

4.1.3酶：需要的酶主要包括DNA聚合酶、尿嘧啶DNA糖基化酶等，應分別明確酶性能的要求，對酶活性、功能性等進(jìn)行評價(jià)和驗證。

4.1.4質(zhì)控品

試劑盒一般包含陰性質(zhì)控品和陽(yáng)性質(zhì)控品。陽(yáng)性質(zhì)控品應采用滅活曲霉培養物。質(zhì)控品需參與樣本處理、核酸的平行提取和檢測的全過(guò)程，以對整個(gè)提取和PCR擴增過(guò)程、試劑/設備、交叉污染等環(huán)節進(jìn)行合理質(zhì)量控制。提交試劑盒質(zhì)控品有關(guān)原料選擇、制備、定值過(guò)程、濃度范圍等試驗資料，對質(zhì)控品的檢測結果Ct值范圍做出明確的要求。

4.1.5內標

內標，又稱(chēng)內對照，可對管內抑制導致的假陰性結果進(jìn)行質(zhì)量控制，應與靶核酸一同提取及擴增。申請人需對內標的引物、探針設計和相關(guān)反應體系的濃度做精確驗證，既要保證內標熒光通道呈明顯的陽(yáng)性曲線(xiàn)又要盡量降低對靶基因檢測造成的抑制。明確內標的檢測結果Ct值范圍。建議科學(xué)設置內標，對待測樣本的取樣質(zhì)量、試劑的反應體系進(jìn)行監控。

4.1.6企業(yè)參考品

該類(lèi)產(chǎn)品的企業(yè)參考品一般包括陽(yáng)性參考品、陰性參考品、檢出限參考品和精密度參考品。應根據產(chǎn)品性能驗證的實(shí)際需要設置企業(yè)參考品。

應提交企業(yè)參考品的原料來(lái)源、選擇、制備、陰陽(yáng)性及濃度確認方法或試劑等相關(guān)驗證資料。企業(yè)參考品應采用臨床樣本，或者使用培養物加入陰性基質(zhì)。呼吸道樣本建議采用滅活的菌株加入模擬基質(zhì)建立企業(yè)參考品。企業(yè)參考品的設置建議如下：

陽(yáng)性參考品：應著(zhù)重考慮不同來(lái)源的曲霉樣本和滴度要求，應至少選取不同病例來(lái)源的3個(gè)曲霉種樣本。對于曲霉屬通用型核酸檢測試劑，陽(yáng)性參考品應至少包含煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉、土曲霉，每個(gè)菌種包含不同病例來(lái)源的3個(gè)曲霉種樣本。（參考品應設置不同濃度水平。）

陰性參考品：主要涉及對交叉反應的驗證情況，建議包括定植部位相同、引發(fā)癥狀相近的其他病原體，包括檢測范圍外的曲霉種（煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉、米曲霉、土曲霉、構巢曲霉）、毛霉目常見(jiàn)菌種、念珠菌屬常見(jiàn)菌種、賽多孢霉、耶氏肺孢子菌、新生隱球菌、馬爾尼菲籃狀菌、鐮刀菌屬、青霉屬。

檢出限參考品：可采用95%陽(yáng)性檢出水平或略高于檢出限的水平，如100%陽(yáng)性檢出水平。對于曲霉屬通用型核酸檢測試劑，應至少包含煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉、土曲霉。

精密度參考品：應包含略高于檢出限濃度水平的陽(yáng)性樣本。

4.2生產(chǎn)工藝研究資料

介紹產(chǎn)品主要生產(chǎn)工藝，可用流程圖結合文字的方式表述。提交主要生產(chǎn)工藝的確定及優(yōu)化研究資料。

（四）臨床評價(jià)資料

該類(lèi)試劑應通過(guò)臨床試驗路徑進(jìn)行臨床評價(jià)。臨床試驗應符合《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》《醫療器械臨床試驗質(zhì)量管理規范》和《體外診斷試劑臨床試驗技術(shù)指導原則》的要求，如相關(guān)法規、文件有更新，臨床試驗應符合更新后的要求。下面僅說(shuō)明該類(lèi)產(chǎn)品臨床試驗中應關(guān)注的重點(diǎn)問(wèn)題。

1.臨床試驗機構

應選擇具備相應條件且按照規定備案的醫療器械臨床試驗機構開(kāi)展臨床試驗。肺曲霉病屬于呼吸系統感染性疾病，建議申請人在呼吸系統疾病及傳染病方面具有優(yōu)勢的臨床機構開(kāi)展臨床試驗。臨床試驗機構數量應不少于3家，且具有分子生物學(xué)方法檢測的優(yōu)勢，試驗操作人員應有足夠的時(shí)間熟悉檢測系統的各環(huán)節（儀器、試劑、質(zhì)控及操作程序等），熟悉評價(jià)方案。在整個(gè)試驗中，試驗體外診斷試劑和對比方法均應處于有效的質(zhì)量控制下，最大限度保證試驗數據的準確性及可重復性。

2.臨床試驗方法

2.1與對比方法的比較研究

2.1.1對于已有同類(lèi)產(chǎn)品上市的，臨床試驗應選擇已上市的同類(lèi)產(chǎn)品作為對比試劑，評價(jià)申報產(chǎn)品與已上市同類(lèi)產(chǎn)品的一致性。對比試劑的選擇應考慮檢測的曲霉范圍、適用的樣本類(lèi)型、產(chǎn)品性能等方面應與試驗體外診斷試劑具有良好的可比性，選擇已上市同類(lèi)產(chǎn)品進(jìn)行臨床試驗時(shí)，對比試劑配套使用的核酸提取試劑應滿(mǎn)足其說(shuō)明書(shū)要求。針對不一致樣本處理，可采用其他已上市同類(lèi)產(chǎn)品、病原體分離培養、測序等方法進(jìn)一步確認。

2.1.2對于尚無(wú)同類(lèi)產(chǎn)品上市的，申請人可采用試驗體外診斷試劑與核酸序列測定（Sanger測序）方法進(jìn)行對比試驗，評價(jià)兩種檢測方法的一致性。同時(shí)還應進(jìn)行部分與曲霉屬分離培養鑒定的對比試驗。以上兩方面評價(jià)結果結合起來(lái)共同論證試驗體外診斷試劑的臨床性能。

臨床試驗資料中應對測序方法進(jìn)行詳細的介紹，應采用公認的靶基因進(jìn)行測序，針對靶基因的選擇應提供依據。明確檢測過(guò)程中配套使用的核酸提取試劑，針對測序方法提交性能驗證數據，證明測序方法與試驗體外診斷試劑的可比性。如測序試驗委托其他機構完成，還應提交由臨床試驗機構委托第三方機構/實(shí)驗室開(kāi)展相關(guān)試驗的測序服務(wù)合同/協(xié)議，提交相關(guān)機構資質(zhì)和選擇依據。

2.2與臨床參考標準的比較研究

在上述比較研究的基礎上，申請人還收集病例的臨床診斷信息，進(jìn)一步評價(jià)申報產(chǎn)品在確診病例、臨床診斷病例、及其他病例中的檢出性能。肺曲霉病診斷的臨床參考標準可參考臨床公認的侵襲性肺曲霉病、慢性肺曲霉病、變應性支氣管肺曲霉病的診斷標準。

3.臨床試驗受試人群的選擇

臨床試驗的受試人群應來(lái)自產(chǎn)品的預期適用人群，該產(chǎn)品的適用人群為臨床需要進(jìn)行肺曲霉病診斷或鑒別診斷的病例。

曲霉是條件致病性真菌，全身或局部免疫缺陷的人群易發(fā)生曲霉感染。臨床試驗入組人群應為易發(fā)生曲霉感染的人群如：粒細胞缺乏、血液系統惡性腫瘤、器官移植、遺傳或獲得性免疫缺陷等人群。肺曲霉亦可發(fā)生在慢性阻塞性肺部疾病、糖尿病等非粒細胞缺乏的人群，因此，臨床試驗也應涵蓋上述人群。

病例入組過(guò)程中應考慮涵蓋不同的肺曲霉病的患者，如侵襲性肺曲霉病、慢性肺曲霉?。▎渭冃苑吻骨?、慢性空洞性肺曲霉病、慢性纖維化性肺曲霉病、曲霉結節、亞急性侵襲性肺曲霉?。?、變應性支氣管肺曲霉病等。

申請人在進(jìn)行臨床試驗時(shí)還應入組部分需要進(jìn)行鑒別診斷的等其他真菌感染患者，此外臨床試驗應納入部分病原體載量較低的病例（其中包括接受抗真菌治療的患者）。

曲霉在自然界廣泛分布，且僅有少數健康人感染曲霉后致病，臨床試驗不建議入組一般健康人群及機體免疫功能（狀態(tài)）正常的人群。

4.臨床試驗樣本類(lèi)型

曲霉核酸檢測可能涉及的樣本類(lèi)型包括痰液、肺泡灌洗液、組織樣本等。臨床樣本的采集建議按照國家衛健委發(fā)布的相關(guān)實(shí)驗室檢測技術(shù)方案執行。

如申報產(chǎn)品適用于不同的樣本類(lèi)型，應針對不同樣本類(lèi)型分別進(jìn)行臨床性能評價(jià)，包括分別進(jìn)行樣本量的估算等。

5.臨床試驗樣本量

建議以與對比方法的比較研究為基礎進(jìn)行樣本量估算。臨床試驗陽(yáng)性樣本和陰性樣本數量應分別滿(mǎn)足統計學(xué)要求。針對與Sanger測序法或同類(lèi)已上市產(chǎn)品的對比試驗，可采用目標值法公式分別估算最低陽(yáng)性和陰性樣本例數。

樣本量估算公式如下，

公式中，n為樣本量；Z1-α/2、Z1-β為顯著(zhù)性水平和把握度的標準正態(tài)分布的分數位，P0為評價(jià)指標的臨床可接受標準，PT為申報產(chǎn)品評價(jià)指標預期值。

其中陽(yáng)性符合率和陰性符合率的臨床可接受標準（P0）建議不低于90%。臨床試驗結果中，相關(guān)評價(jià)指標的95%置信區間下限應不低于預設的臨床可接受標準。當評價(jià)指標P接近100%時(shí)，上述樣本量估算方法可能不適用，應考慮選擇更加適宜的方法進(jìn)行樣本量估算和統計學(xué)分析，如精確概率法等。

對人類(lèi)致病的曲霉最常見(jiàn)的是煙曲霉、其次是黃曲霉、黑曲霉、土曲霉和構巢曲霉等，針對曲霉屬通用型核酸檢測試劑，臨床試驗入組病例應至少能夠涵蓋臨床常見(jiàn)的曲霉種：煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉。

曲霉為具有細胞壁的真菌，核酸提取試劑的性能直接影響產(chǎn)品的檢測性能。如申報產(chǎn)品配套多個(gè)核酸提取試劑，臨床試驗應以一種核酸提取試劑為主開(kāi)展臨床試驗，其余配套核酸提取試劑應在不少于兩家臨床試驗機構，選擇不低于200例病例進(jìn)行臨床研究。入組病例中陰陽(yáng)性病例的分配應能夠滿(mǎn)足評價(jià)產(chǎn)品性能要求。

6.臨床試驗結果的統計分析

臨床試驗結果一般以四格表的形式進(jìn)行總結，并據此計算試驗體外診斷試劑的靈敏度和特異度，或與對比方法的陽(yáng)性/陰性符合率及其95%置信區間。

臨床試驗報告中應對入組受試者的基本情況進(jìn)行分析，包括受試者年齡、性別的分布情況，以及臨床診斷背景等。特別應針對用于特異性評價(jià)的各類(lèi)受試者進(jìn)行歸類(lèi)匯總，確認入組樣本具有較好的代表性。臨床試驗中如涉及不同樣本類(lèi)型，應針對每種樣本類(lèi)型分別進(jìn)行統計分析。

曲霉屬通用型核酸檢測試劑，應對每種曲霉檢測的臨床性能進(jìn)行分層分析，不同曲霉間產(chǎn)品性能應不存在顯著(zhù)差異。

臨床試驗中所有不一致結果均應結合患者的流行病學(xué)背景、臨床癥狀、臨床診斷以及疾病治療、轉歸等信息進(jìn)行充分的分析。臨床試驗結果應能夠證明產(chǎn)品臨床性能滿(mǎn)足臨床要求。

7.境外臨床試驗數據的認可

境外臨床試驗數據應符合《接受醫療器械境外臨床試驗數據技術(shù)指導原則》和《使用體外診斷試劑境外臨床試驗數據的注冊審查指導原則》的相關(guān)要求。提交完整的臨床試驗方案、報告和倫理審查意見(jiàn)，以及該數據適用于中國患者人群的論證資料、境內外臨床試驗質(zhì)量管理差異的對比資料和臨床試驗質(zhì)量管理差異對于臨床試驗結果影響的論證資料。

注冊申請人應根據上述臨床試驗技術(shù)審評要求，論證境外臨床試驗數據的充分性。

8.臨床證據的形式要求

申請人應按照《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》、《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告》等法規文件要求提交各機構倫理審查意見(jiàn)、臨床試驗方案、臨床試驗小結、臨床試驗報告以及臨床試驗數據庫。

臨床試驗數據匯總表中應提供病例的臨床診斷結果及支持病例臨床診斷結果的信息。

9.其他注意事項

該類(lèi)產(chǎn)品樣本處理及核酸提取試劑會(huì )影響產(chǎn)品檢測性能，臨床試驗在選擇已上市同類(lèi)產(chǎn)品進(jìn)行臨床試驗時(shí)，特別注意，對比試劑配套使用的核酸提取試劑應滿(mǎn)足其說(shuō)明書(shū)要求。

（五）產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)和標簽樣稿

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)格式應滿(mǎn)足《體外診斷試劑說(shuō)明書(shū)編寫(xiě)指導原則》的要求。產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)中技術(shù)內容應與注冊申報資料中的相關(guān)研究結果保持一致，如某些內容引用自參考文獻，應以規范格式進(jìn)行標注，并單獨列明文獻的相關(guān)信息。曲霉核酸檢測試劑說(shuō)明書(shū)編寫(xiě)應重點(diǎn)關(guān)注以下內容。

1．【預期用途】

1.1本試劑盒用于體外定性檢測需要進(jìn)行xxx病診斷或鑒別診斷者的xxx樣本（具體描述樣本類(lèi)型）中的曲霉屬（或某一曲霉種DNA。

1.2臨床上易發(fā)生曲霉感染的人群如：粒細胞缺乏、血液系統惡性腫瘤、器官移植、遺傳或獲得性免疫缺陷、慢性阻塞性肺部疾病、糖尿病等人群。

1.3簡(jiǎn)單介紹曲霉病原學(xué)特征、流行病學(xué)特征以及臨床表現和現有診斷方法等。

1.4強調本試劑盒檢測結果僅供臨床參考，不得作為臨床診斷的唯一標準。建議結合患者臨床表現和其他實(shí)驗室檢測對病情進(jìn)行綜合分析。

2.【檢驗原理】

簡(jiǎn)述產(chǎn)品的核酸提取和PCR原理。明確內標基因名稱(chēng)及其作用。如采用了防污染措施，進(jìn)行簡(jiǎn)要描述。

3.【主要組成成分】

明確試劑盒中各組分及具體成分。明確需要但未提供的材料，例如核酸提取試劑，樣本保存液，樣本消化液等的產(chǎn)品名稱(chēng)，生產(chǎn)廠(chǎng)家，貨號或注冊證號、備案號等信息。

4.【樣本要求】

需詳細描述樣本采集、保存、運輸和處理方式，包括采樣步驟，采樣量，保存液、消化液的使用體積，滅活方式等。描述樣本及核酸提取液的保存穩定性。

5.【檢驗方法】

明確核酸提取用的樣本體積、洗脫體積和PCR加樣體積，陰、陽(yáng)性質(zhì)控品與待測樣本同步進(jìn)行核酸提取操作。明確各適用機型的反應參數設置。明確質(zhì)控品和內標的檢測結果Ct值范圍，作為試驗有效性的標準。

6.【陽(yáng)性判斷值】

簡(jiǎn)述陽(yáng)性判斷值確定的方法，包括研究人群特征、研究樣本量和統計分析方法等。

7.【檢驗結果的解釋】

通過(guò)擴增曲線(xiàn)和Ct值進(jìn)行結果陰陽(yáng)性的判斷，列明結果陰性、陽(yáng)性、復測、無(wú)效等所有情形。

8.【檢驗方法的局限性】

8.1本試劑盒的檢測結果僅供臨床參考，對患者的臨床診治應結合其癥狀/體征、病史、其他實(shí)驗室檢查及治療反應等情況綜合考慮。

8.2有關(guān)假陽(yáng)性結果的可能性分析

8.2.1如果樣本在運輸、處理過(guò)程中發(fā)生交叉污染，則可能導致假陽(yáng)性結果；

8.2.2試驗環(huán)境有PCR產(chǎn)物等氣溶膠污染，則可能導致假陽(yáng)性結果；

8.2.3試驗過(guò)程中使用的耗材、設備等受污染，則可能導致假陽(yáng)性結果。

8.3有關(guān)假陰性結果的可能性分析

8.3.1不合理的樣本采集、轉運、儲存及處理、樣本中病原體含量過(guò)低均有可能導致假陰性結果；

8.3.2該病原體待測靶序列的變異或其他原因導致的序列改變可能會(huì )導致假陰性結果；

8.3.3未經(jīng)驗證的其他干擾或PCR抑制因子等可能會(huì )導致假陰性結果。

8.4本試劑盒不能區分真菌污染、定植和感染，應結合臨床癥狀和其他檢查結果綜合判斷。

9.【產(chǎn)品性能指標】

簡(jiǎn)述試劑性能指標和研究情況，建議包含：參考品的符合性、準確性、檢出限、包容性、精密度、分析特異性、臨床試驗等。

10.【注意事項】

10.1試劑保存運輸及使用過(guò)程中多種因素可能導致性能變化，如保存運輸不當、樣本采集、樣本處理及檢測過(guò)程操作不規范等，請嚴格按照說(shuō)明書(shū)操作。

10.2生物安全防護相關(guān)內容

10.3避免實(shí)驗室污染的措施

三、參考文獻

[1] 國家藥品監督管理局. 關(guān)于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告: 國家藥品監督管理局公告2021年第122號[Z].

[2] 國家食品藥品監督管理總局.體外診斷試劑說(shuō)明書(shū)編寫(xiě)指導原則: 國家食品藥品監督管理總局公告2014年第17號[Z].

[3] 國家藥品監督管理局醫療器械技術(shù)審評中心.定性檢測試劑分析性能評估注冊審查指導原則: 國家藥品監督管理局醫療器械技術(shù)審評中心公告2022年第36號[Z].

[4] 國家藥品監督管理局 國家衛生健康委員會(huì ). 醫療器械臨床試驗質(zhì)量管理規范：國家藥監局 國家衛生健康委關(guān)于發(fā)布醫療器械臨床試驗質(zhì)量管理規范的公告2022年第28號[Z].

[5] 國家食品藥品監督管理總局. 接受醫療器械境外臨床試驗數據技術(shù)指導原則：食品藥品監管總局關(guān)于發(fā)布接受醫療器械境外臨床試驗數據技術(shù)指導原則的通告2018年第13號[Z].

[6] 國家藥品監督管理局. 體外診斷試劑臨床試驗技術(shù)指導原則: 國家藥品監督管理局通告2021年第72號[Z].

[7] 國家藥品監督管理局. 使用體外診斷試劑境外臨床試驗數據的注冊審查指導原則: 國家藥品監督管理局通告2021年第95號[Z].